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Title: Avaliação dos indicadores de metabolismo, metilação do DNA e polimorfismos funcionais de MTHFR (rs1801133, C677T; rs1801131, A1298C) em gliomas
Authors: Faria, Giselle Marianne
metadata.dc.contributor.advisor: Santos, Thereza Fonseca Quírico dos
metadata.dc.contributor.members: Santos, Thereza Fonseca Quírico dos
Landeiro, José Alberto
Santos, Márcia Rodrigues Amorim dos
Souza, Marcus André Acioly de
Issue Date: 2017
Citation: FARIA, Giselle Marianne. Avaliação dos indicadores de metabolismo, metilação do DNA e polimorfismos funcionais de MTHFR (rs1801133, C677T; rs1801131, A1298C) em gliomas. 2017. 135 f. Dissertação (Mestrado em Neurologia/Neurociências) - Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2017.
Abstract: Introdução: Gliomas constituem o tumor cerebral primário de origem neuroepitelial mais comum, agressivo e fatal em adultos, e caracterizado por padrão anabólico acelerado, altamente proliferativo e infiltrativo. O tratamento com quimioterapia citotóxica e altas doses de radiação ionizante induzem efeitos secundários de instabilidade genômica, mutações somáticas, e alterações epigenéticas relacionadas à metilação do DNA. Objetivo: Analisar a presença de marcadores moleculares relacionados ao metabolismo de ácidos nucleicos e polimorfismos funcionais em enzima da via metabólica do folato, considerados críticos nos processos de síntese e metilação do DNA. Material e Métodos: A coorte incluiu 154 pacientes com glioma maligno recidivo em estágio terminal. Os pacientes foram agrupados conforme a classificação histológica (GBM = 104; AA = 36) e localização da lesão tumoral (lobar: n=105; profunda: n=47). DNA genômico (gDNA) foi extraído de células sanguíneas periféricas e analisado quanto ao percentual de metilação global (n=118), presença de polimorfismos (snps, n = 96) no gene MTHFR (C677T, rs1801133 e A1298C, rs1801131), e genotipagem pareada (n=11) em amostras do gDNA e DNA tumoral. Amostras de soro foram utilizadas para dosagem de ácido úrico (n=82) e homocisteína (n=72). Análise estatística incluiu testes não paramétricos, análises de correlação de Spearman (bivariável e ponto bisserial), teste do Chi-quadrado e análise de loglinear utilizando programa SPSS 20.0, com um intervalo de confiança de 95% (p<0,05). Resultados e Discussão: 48,8% dos pacientes apresentaram aumento (p<0,001) nos níveis de ácido úrico. Todos os pacientes apresentaram homocisteína elevada (8 vezes; > 100μM) e 75% (p<0,001) apresentaram hipometilação global do gDNA. Foi encontrada uma correlação significativa, negativa e moderada entre os níveis de homocisteína e hipometilação global (p=0,041; rho= - 0,369; n=31). 59,4% dos pacientes apresentaram pelo menos um alelo mutado para rs1801133 (C677T; 45,83% = CT e 13,54% = TT) e 47% apresentaram pelo menos um alelo mutado para rs1801131 (A1298C; AC = 40,62% e CC = 6,26%). Pacientes com genótipo TT para rs1801133 (C677T) apresentaram redução significativa (p=0,043) na hipometilação de gDNA, e correlação significativa, negativa e moderada (p=0,005; rho= - 0,517; n=28) entre essas duas variáveis. A combinação de genótipos CT_AA indicou uma contribuição individual forte e significativa (p=0,045, escore Z=2,004) para a metilação do gDNA. Pacientes com percentual de metilação até 50% apresentaram diferença entre os diplotipos CC_AC e CT_AA (p<0,1) e tendência a menor hipometilação também para o diplotipo TT_AA. Foi observada diferença significativa entre localização profunda e lobar (p=0,044) e correlação significativa, negativa e fraca (p=0,043; rho= - 0,271; n=56) entre a localização profunda e hipometilação global do gDNA com decréscimo 1,6 vezes no percentual de hipometilação. Estudos de associação genética evidenciaram contribuições individuais fortes e significativas para modelo de hereditariedade aditivo (rs1801133, C677T: p<0,001; escore Z = 4,306 / rs1801131, A1298C: p= 0,005; escore Z= 2,799) e dominante (rs1801133, C677T: p=0,011; escore Z = 2,557 / rs1801131, A1298C: p=0,065; escore Z=1,848) para ambos os snps, para os homozigotos mutados (rs1801133, C677T: p<0,001; escore Z = - 4,207 / rs1801131, A1298C: p<0,001; escore Z= - 4,437) e para a histologia (rs1801133, C677T: p<0,001; escore Z = - 5,765 / rs1801131, A1298C: p<0,001; escore Z = 4,983). Também foi possível evidenciar contribuições individuais fortes e significativas para modelo de hereditariedade aditivo (rs1801133, C677T: p<0,001; escore Z = 4,699 / rs1801131, A1298C: p= 0,005; escore Z= 2,806) e dominante (rs1801133, C677T: p=0,005; escore Z = 2,779), para homozigotos mutados (rs1801133, C677T: p<0,001; escore Z = - 4,019 / rs1801131, A1298C: p<0,001; escore Z= - 4,279) e para localização tumoral (rs1801133, C677T: p=0,001; escore Z = 3,315 / rs1801131, A1298C: p=0,010; escore Z= 2,593). Foram encontradas contribuições individuais fortes e significativas para as combinações de genótipo homozigoto duplo mutado para ambos snps (p<0,001; escore Z = - 4,701), para os modelos aditivos combinados de ambos os snps (p=0,035, escore Z=2,100); para a combinação do genótipo duplo mutado do rs 1801131 (A1298C) tanto com o modelo aditivo (p=0,025, escore Z=-2,248) como com o modelo dominante do rs1801133 (C677T, p=0,006, escore Z=-2,760) e para a histologia (p<0,001, escore Z=9,019).Os estudos de associação genética identificaram contribuições individuais fortes e significativas para combinação de genótipo homozigoto duplo mutado para ambos snps (p<0,001; escore Z = - 5,594), para os modelos aditivos combinados de ambos os snps (p<0,001, escore Z=5,425) e para a combinação do modelo dominante do rs1801133 (C677T) com o modelo aditivo do rs1801131 (A1298C, p<0,001, Z=3,925) e para a localização tumoral (p<0,001, escore Z=4,724). A análise pareada entre o gDNA dos pacientes e o DNA tumoral evidenciou alterações genéticas no gene MTHFR (63,3%) dos pacientes. Conclusão: Mesmo após a recidiva tumoral, foi possível identificar diferenças significativas no percentual de hipometilação do gDNA de pacientes com glioma recidivo, sendo o genótipo TT do rs 1801133 (C677T) e a localização profunda variáveis contribuindo significativamente para redução proeminente no padrão de hipometilação. Considerando-se a correlação negativa entre metilação global do DNA e os níveis de homocisteína, o acompanhamento periódico e análise em conjunto dos snps da via do folato devem ser considerados parâmetros indicadores sugestivos de progressão / recorrência. A bagagem genética individual em modelos de contraste específicos, isolados ou combinados pode fornecer ferramentas para acompanhamento dos pacientes com glioma maligno minimizando influências epigenéticas
metadata.dc.description.abstractother: Introduction: Gliomas are primary neuroepithelial brain tumor most common, aggressive and fatal in adults with high proliferative, anabolic pattern, and invasiveness. Treatment with cytotoxic hemotherapy and high doses of ionizing radiation induce genomic instability, somatic mutations, DNA methylation and epigenetic changes. Aim: To analyze the presence of molecular markers related to nucleic acids metabolism and genetic polymorphisms in folate metabolic pathway checkpoint enzyme, considered critical in the processes of synthesis and DNA methylation. Material and Methods: The cohort included 154 patients with recurrent malignant glioma at terminal stage. Patients were grouped according to histological classification (GBM = 104; AA = 36) and location of the tumor lesion (lobar: n = 105; deep: n = 47).Genomic DNA (gDNA) was extracted from peripheral blood cells and analyzed for global methylation percentage (n = 118), presence of polymorphisms (snps) in the MTHFR gene (n = 96; C677T,rs1801133 and A1298C, rs1801131), and paired gDNA and tumor DNA genotyping (n = 11).Serum samples were used for determination of uric acid (n = 82) and homocysteine (n = 72). Statistical analysis included nonparametric tests, Spearman correlation analysis (point-biserial correlation), Chisquared test and loglinear analysis using SPSS program 20.0, with a confidence interval of 95% (p<0.05). Results and discussion: 48.8% of patients had increased (p < 0.001) levels of uric acid. Homocysteine showed increase for all patients (8 times; >100μM), and 75% (p < 0.001) showed global gDNA hypomethylation. It was found a significant, negative and moderate correlation (p = 0.041; rho =-0.369; n = 31) between homocysteine levels and global hypomethylation. Patients (59.4%) had at least one mutated allele for rs1801133 (C677T; 45.83% = CT and TT=13.54%) and 47% showed at least one mutated allele for rs1801131 (A1298C; AC = 40.62%; CC = 6.26%). Patients with TT genotype for rs1801133 (C677T) showed a significant reduction in gDNA hypomethylation (p = 0.043), and significant, negative and moderate correlation (p = 0,005; rho = - 0.517; n = 28) between these two variables. Combination of CT_AA genotypes indicated a strong individual and significant contribution (p = 0.045, Z score = 2.004) for gDNA methylation. Patients with methylation up to until 50% had a difference between CC_AC and CT_AA (p < 0.1) diplotypes and slight hypomethylation also found for TT_AA diplotype. A further significant difference (p = 0.044) was observed between deep and lobar tumor location, and also a significant, negative and weak correlation (p = 0.043; rho =-0.0271; n = 56) between tumor deep location and global gDNA hypomethylation (1.6 times reduction).Genetic association studies indicated strong and significant individual contributions to additive inheritance model (rs1801133, C677T: p<0.001; Z score = 4.306/rs1801131, A1298C: p = 0.005; Z = 2.799 score) and dominant (rs1801133, C677T: p = 0.011; Z score = 2.557/rs1801131, A1298C: p = 0.065; Z = 1.848 score) for both snps and homozygous mutant (rs1801133, C677T: p < 0.001;Z score= -4.207 / A1298C, rs1801131: p < 0.001 =; Z score =-4.437) and histology (rs1801133, C677T: p <0.001; Z score = - 5.765/rs1801131, A1298C: p< 0.001; Z score = 4.983). It was also possible to observe strong and significant individual contributions to the additive inheritance model (rs1801133, C677T: p <0.001; Z score = 4.699 / rs1801131, A1298C: p = 0.005; Z score = 2.806) and dominant (rs1801133, C677T: p = 0.005; Z score = 2.779), to mutated homozygous (rs1801133, C677T: p< 0.001; Z score = -4.019 / rs1801131, A1298C:p<0,001; Z score =;-4.279), and tumor location (rs1801133, C677T: p = 0.001; Z score = 3.315/rs1801131, A1298C: p = 0.010; Z score = 2.593). Regarding combination of genotypes/contrast models we found strong and significant individual contributions to double mutated homozygous genotype combinations for both snps(p< 0.001; Z score = - 4.701), for combined additive models of both snps (p=0.035, Z score =2.100); for the combination of double mutated rs 1801131 genotype (A1298C) both with the additive model(p=0,025, score Z=-2,248) the dominant model of rs1801133 (C677T, p=0.006, score Z=-2.760), and for histology (p<0.001, score Z=9.019). Genetic association studies also identified strong and significant individual contributions to double mutate homozygous genotype combination for both snps (p<0.001; Z score = - 5.594), for combined additive models for both snps (p<0.001, Z score =5.425) and for combination of the dominant model of rs1801133 (C677T) with the additive rs1801131 model (A1298C, p<0.001, score Z=3.925), and for tumor location (p<0.001, score Z=4.724). Paired analysis between patients’ gDNA and tumor DNA showed genetic changes in MTHFR gene in 63.3% of patients. Conclusion: Even after tumor recurrence, it was possible to identify significant differences in the percentage of gDNA hypomethylation among glioma patients, being the TT genotype of rs 1801133 (C677T) and deep location variables contributing to prominent reduction in pattern of DNA hypomethylation. Considering the negative correlation between global DNA methylation and homocysteine levels, periodic monitoring and analysis of snps in the folate pathway may help personalized intervention for each patient. Analysis of individual molecular characteristics using adequate statistic models can be used as strategic tools to reveal and mitigate epigenetic influences influencing tumor progression and recurrence.
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/10630
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