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Title: Análise do surto respiratório e da atividade fagocítica de neutrófilos humanos em sangue total: aplicação ao estudo de pacientes com fibrose cística
Authors: Praxedes, Anísia Torquilho
metadata.dc.contributor.advisor: Elsas, Pedro Paulo Xavier
metadata.dc.contributor.advisorco: Vasconcelos, Zilton Farias Meira de
metadata.dc.contributor.members: Dias, Eliane Pedra
Boechat, Neio Lucio Fernandes
Cunha, José Marcos Telles
Issue Date: 2010
Citation: PRAXEDES, Anísia Torquilho. Análise do surto respiratório e da atividade fagocítica de neutrófilos humanos em sangue total: aplicação ao estudo de pacientes com fibrose cística. 2010. 156 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2010.
Abstract: A Fibrose Cística (FC) é uma doença autossômica recessiva, caracterizada pela disfunção de uma proteína, codificada pelo gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), responsável pela regulação do fluxo de diversos íons, em especial dos íons Cl-. Indivíduos fibrocísticos apresentam alterações de composição e viscosidade das secreções exócrinas e da interface fluida que reveste as vias aéreas. Estas alterações são decisivas para que estes fluidos não sejam eliminados de forma adequada, o que propicia tanto a obstrução de ductos glandulares como o estabelecimento de infecções pulmonares com suscetibilidade aumentada para Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e bactérias do complexo Burkholderia. Nestes pacientes, infecção e inflamação são fatores interdependentes e concomitantes, porém distintos, que contribuem para a deterioração da função pulmonar. Num contexto imunológico, os mecanismos de imunidade são incapazes de erradicar a infecção. Considerando que as mutações do gene CFTR podem afetar, direta ou indiretamente, a função dos neutrófilos por gerarem um defeito seletivo da atividade microbicida, e que este defeito prejudica a interação dos neutrófilos com os patógenos, este trabalho teve como objetivo avaliar, em citometria de fluxo, a atividade funcional de neutrófilos humanos em pacientes fibrocísticos. Para isto, buscou-se definir diferenças quantitativas na atividade fagocítica e na ativação do surto respiratório entre pacientes e controles saudáveis. Foram avaliadas 43 amostras de pacientes, diagnosticados com Fibrose Cística (FC), atendidos no Instituto Fernandes Figueira, instituição pública de referência do Estado do Rio de Janeiro, e 89 amostras de controles saudáveis. Os experimentos foram realizados, utilizando amostras de sangue periférico, coletadas com anticoagulante. A avaliação do surto respiratório foi realizada a partir da oxidação de dihidrorodamina em rodamina, utilizando forbol-12-miristrato-13-acetato como ativador celular. Para avaliação da fagocitose, foram utilizadas bactérias geneticamente modificadas, que superexpressam a proteína fluorescente verde. No estudo, a mutação no gene CFTR mais comum é a ΔF508, presente tanto em homozigose (12%) como em associação com outras mutações de CFTR (58%). Nos fibrocísticos, tanto o surto respiratório como a atividade fagocítica parecem estar afetados, e há uma tendência ao decréscimo de resposta com o aumento da idade em ambos os parâmetros. Porém, observa-se diferença da atividade oxidativa entre os pacientes, relacionadas à idade e ao sexo. Esses resultados reforçam a idéia de que os neutrófilos desses pacientes têm a capacidade funcional diminuída com o avanço da idade, mesmo quando não foram colhidos de sítios inflamados. Estas observações sugerem que um defeito adquirido na imunidade inata, expresso na população neutrofílica, se desenvolve após vários anos de doença nos pacientes sem necessidade de exposição do neutrófilo a um microambiente inflamado
metadata.dc.description.abstractother: Cystic Fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease characterized by the dysfunction of a protein encoded by the gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), responsible for regulating the flow of various ions, especially CI-. CF patients present changes in composition and viscosity of exocrine secretions and in the fluid interface lining the airways. These changes interfere with proper elimination of these fluids, thereby increasing the risk of glandular duct obstruction, and favouring subsequent colonization of the lungs with pathogens such Pseudomonas aeruginosa, staphylococcus aureus and the bacteria of the Burkholderia complex. In these patients, infection and inflammation are interdependent and concomitant factors, however distinct, that contribute to the longterm deterioration of pulmonary function. From an immunological standpoint, the mechanisms of immunity are unable to eradicate these infections. Considering that the mutations in the CFTR gene may directly or indirectly affect the function of the neutrophils by a selective defect of their microbicidal activity and that this defect affects the interaction of neutrophils with pathogens, this study aimed to evaluate, through flow cytometric analyses, the functional activity of human neutrophils, and to further define quantitative differences in the phagocytic activity and in the activation of the respiratory burst between CF patients and healthy individuals. This study included 43 samples from FC patients who were treated in reference center at public institution of the Rio de Janeiro State, as well as 89 samples from healthy individuals. The experiments were conducted using peripheral blood samples collected with anticoagulant. The evaluation of the respiratory burst was made from the oxidation of dihydrorhodamine 123 in rhodamine 123, using phorbol-12-myristate-13-acetate as a cell activator. For the evaluation of phagocytosis, genetically altered bacteria overexpressing green fluorescent protein were used. The most common CFTR mutation found in this study was ΔF508, both in homozygosis (12%) and in association with other CFTR mutations (58%). In the FC patients, both the respiratory burst and phagocytic activity were affected, showing a decreasing trend with increasing age. These results support the view that neutrophils from CF patients have a diminished functional capacity as they grow older, even when neutrophils were not collected from inflammatory sites. These observations suggest that an acquired defect in innate immunity, expressed in circulating neutrophils, develops after several years of disease activity, independently of exposure to the microenvironment of inflammatory
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/11693
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