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Title: Comparação entre cinco diferentes métodos de extração de RNA exossomal de sobrenadante de saliva liofilizado
Other Titles: Comparison among five different methods of extracting exosomal RNA from lyophilized saliva supernatant
Authors: Cruz, Valquíria Quinelato
metadata.dc.contributor.advisor: Casado, Priscila Ladeira
metadata.dc.contributor.advisorco: Granjeiro, José Mauro
Issue Date: 2018
Abstract: Os miRNAs salivares apresentam-se como um potencial biomarcador por ser mensurável, previamente ou durante, à manifestação clínica de inúmeras doenças, assim como são alvos terapêuticos para o desenvolvimento de medicamentos. No entanto, não há protocolos específicos, pré-definidos, para obtenção de miRNA salivar. Por isso, o objetivo deste estudo foi realizar uma análise comparativa do desempenho do isolamento manual e purificação de miRNA de saliva, pelo processo de liofilização, comparando 5 diferentes métodos. A coleta de saliva foi realizada por meio de bochecho com solução fisiológica a 0,9% por 1 minuto. O método de isolamento do sobrenadante da saliva foi baseado em centrifugações escalonadas seguidas de liofilização, isolando as vesículas extracelulares. Posteriormente, isolouse o RNA total por 5 diferentes métodos: Trizol, mirCURYTM RNA Isolation Kit, mirCURYTM RNA Isolation Kit modificado, RNA total mirVanaTM miRNA Isolation kit, Small RNA mirVanaTM miRNA Isolation kit, seguido de purificação por solução de clorofórmio/fenol 1:1. A avaliação da concentração e pureza do RNA total foi realizada através do espectofotômetro . A reação em cadeia polimerase confirmou a presença de miRNAs nas amostras isoladas. De acordo com o método utilizado, a concetração do miRNA obtido foi de 162,47(±22,57) - 234,33(±26,97) ng/µl, , apresentando razão de pureza (260/280) de 1,71(±0,03) - 1,85(±0,08) e razão (260/230) de 1,88(±0,15) - 2,11(±0,06). A análise por Real Time PCR quantitativo demonstrou a presença do mir-146b nas amostras isoladas pelos 5 métodos. Quatro métodos analisados foram capazes de isolar RNA total de sobrenadante de saliva liofilizado com razão de pureza (260/280) superior a 1,79 (±0.02). O método total RNA mirVana apresentou amostras mais ricas em microRNA em relação aos demais métodos analisados, apresentando assim menor valor médio C(q)=29.80(±0.95)
metadata.dc.description.abstractother: Salivary miRNA is a potential biomarker because they are measurable, before or during the clinical manifestation of numerous diseases, as well as being therapeutic targets for drug development. However, there are no specific, pre-defined protocols for obtaining salivary miRNA. Therefore, the objective of this study was to conduct a comparative analysis of the performance of manual isolation and purification of saliva miRNA through the lyophilization process, comparing 5 different methods. Saliva samples were collected by rinsing the mouth with 0.9% physiological saline solution for 1 minute. The method of isolating saliva supernatant was based on stepwise centrifugations followed by lyophilization, isolating the extracellular vesicles. Subsequently, total RNA was isolated using 5 different methods: Trizol, mirCURYTM RNA Isolation Kit, mirCURYTM RNA Isolation Kit modificado, RNA total mirVanaTM miRNA Isolation kit, Small RNA mirVanaTM miRNA Isolation kit; followed by purification using 1:1 phenol/chloroform solution. The total RNA concentration and purity was assessed via spectrophotometer. Polymerase chain reaction confirmed the presence of miRNAs in the isolated samples. According to the method used, the concentration of miRNA obtained was 162.47(±22.57) - 234.33(±26.97) ng/µl, presenting a purity ratio (260/280) of 1.71(±0.03) - 1.85(±0.08) and a 260/230 ratio of 1.88(±0.15) - 2.11(±0.06). Quantitative Real Time PCR analysis demonstrated the presence of mir-146b in the samples isolated by the 5 methods. Four methods analyzed were able to isolate total RNA from freeze-dried saliva supernatant with a (260/280) purity ratio greater than 1.79(±0.02). The total RNA mirVana method presented richer samples in microRNA if compared to the other analyzed methods, thus presenting a lower mean value C (q) = 29.80 (± 0.95)
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/11780
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