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Title: Avaliações comparativas morfofisiológica e molecular entre isolados clínicos e cepas padrão do gênero Sporothrix
Authors: Sales, Pãmella Antunes de Macêdo
metadata.dc.contributor.advisor: Baptista, Andréa Regina de Souza
metadata.dc.contributor.advisorco: Santos, André Luis Souza dos
metadata.dc.contributor.members: Castro, Tatiana Xavier de
Machado, Ricardo Luiz Dantas
Neves, Gabriela Westerlund Peixoto
Gremião, Isabella Dib Ferreira
Issue Date: 2019
Abstract: A esporotricose é uma micose de implantação traumática, causada por fungos patogênicos e dimórficos do gênero Sporothrix. No Brasil, a transmissão do Sporothrix brasiliensis pelo gato doméstico com esporotricose é a via majoritária, com números crescentes, alarmantes. De fato, os gatos mostram interação única com este fungo, possivelmente determinado por sua alta susceptibilidade, apresentando formas severas da doença, que requerem tratamento prolongado. Por outro lado, essas características poderiam favorecer a coinfecção com outros microrganismos agravando ainda mais o quadro clínico desses animais. O objetivo do estudo foi avaliar e comparar características fenotípicas e genotípicas entre as espécies patogênicas do Sporothrix, a partir de isolados clínicos e/ou cepas padrão de origem zoonótica e sapronótica. Para tanto, leveduras, conídios e micélios de três cepas de referência (S. schenckii; S. globosa e S. brasiliensis) e oito isolados clínicos do S. brasiliensis foram analisados. Os isolados clínicos foram recuperados de quatro gatos (CIM01-CIM04) com esporotricose (2 isolados/animal) do estado do Rio de Janeiro, Brasil. Estes apresentavam pigmentação distinta na cultura micológica, denominada “Light” e “Dark”. Os isolados Dark produziram maiores quantidades de melanina (P ≤ 0,05). Os conídios das cepas de referência apresentaram o mesmo tamanho, mas a S. globosa apresentou menor complexidade celular quando comparada a outras cepas (P < 0,01). Os isolados clínicos apresentaram os dois parâmetros compatíveis com a cepa de referência de S. brasiliensis. Leveduras das cepas padrão tinham o mesmo tamanho, porém S. schenckii e S. brasiliensis foram mais complexas (P < 0,05). A complexidade dos isolados clínicos, comparada à sua cepa padrão, apresentou maior heterogeneidade (P < 0,05). A análise por PCR identificou todos os isolados clínicos como S. brasiliensis, idiomorfo MAT1-2. O sequenciamento dos genes da β-tubulina e da calmodulina, seguido de análise filogenética, alocou todos os isolados dentro do mesmo cluster que os demais da área hiperendêmica brasileira. No geral, as atividades enzimáticas dos Sporothrix variaram de "não-produtores", produção reduzida (Pz 0.99 a 0.70) e elevada (Pz 0.399 a 0.100). Todos os isolados/espécies foram capazes de produzir pelo menos duas enzimas. A produção de fitase não foi detectada. As leveduras e os micélios de todos fungos formaram biofilme tempo-dependente. Concentração Inibitória Mínimas (CIM) para anfotericina B, terbinafina, caspofungina, micafungina, itraconazol, fluconazol e voriconazol foram obtidos (CLSI M38-A2/M27-A3). Comparações entre pares mostraram CIMs divergentes entre os isolados Light e Dark para cada um dos pares, superiores a pelo menos duas diluições, para pelo menos um dos antifúngicos testados. Analisamos também a capacidade desses isolados para estimular a produção de citocinas pelas PBMCs humanas. Os isolados CIM01 e CIM03 Light e Dark mostraram perfis semelhantes de citocinas para a cepa padrão do S. brasiliensis; enquanto os CIM02 e CIM04 comportaram-se diferentemente (P < 0,001). Como os isolados do S. brasiliensis Light e Dark apresentam diferentes parâmetros fenotípicos, é bastante provável que a coinfecção seja uma ocorrência comum com implicações clínicas na dinâmica da esporotricose felina.
metadata.dc.description.abstractother: Sporotrichosis is a mycosis of traumatic implantation, caused by pathogenic dimorphic fungi of genus Sporothrix. In Brazil, Sporothrix brasiliensis transmission by cat with sporotrichosis is the majority route, with increasing numbers, alarming. Indeed, cats show a unique interaction with this fungus, possibly determined by its high susceptibility, displaying severe disease forms, which require prolonged antifungal administration. On the other hand, these characteristics could favor co-infection with other microorganisms, further aggravating the clinical condition of these animals. We aimed to evaluate and compare phenotypic and genotypic characteristics of potential clinical implication among the pathogenic species of Sporothrix, from clinical isolates and/or reference strains of zoonotic and sapronous origin. Yeasts, conidia and mycelia of three reference strains (S. schenckii ATCC MYA-4821; S. globosa CBS 120340 and S. brasiliensis ATCC MYA-4823) as well as eight S. brasiliensis clinical isolates were used in the present study. These eight clinical isolates were recovered from four cats (CIM01-CIM04) with sporotrichosis (paired isolates per animal) from Rio de Janeiro state, Brazil. These presented distinct pigmentation in mycological culture, named “Light” and “Dark”. Dark isolates produced higher quantities of melanin (P≤0.05). The conidia of the reference strains presented the same size, but the S. globosa presented lower cellular complexity when compared to other strains (P < 0,01). Clinical isolates presented the two parameters compatible with the reference of S. brasiliensis. Reference strains’ yeasts showed same size, however S. schenckii and S. brasiliensis were more complex than S. globosa (P < 0,05). The complexity of clinical isolates compared to their reference strain shows greater heterogeneity (P < 0,05). PCR identified all clinical isolates as S. brasiliensis, MAT1-2 idiomorph. Sequencing of β-tubulin and calmodulin genes followed by phylogenetic analysis set all isolates within the same cluster as others from the Brazilian hyperendemic area. Overall, the enzymatic activities varied from "non-producers" to low (Pz 0.99 to 0.70) and higher (Pz 0.399 to 0.100) producers. All species/strains were able to produce at least two enzymes. Phytase production was not detected. Yeasts and mycelia from all strains formed biofilm on polystyrene in a typical time-dependent process. MICs for amphotericin B, terbinafine, caspofungin, micafungin, itraconazole, fluconazole, and voriconazole were obtained (CLSI M38-A2/M27-A3). Pairwise comparisons showed distinct MICs between Sporothrix Light and Dark isolates for each one of the pairs, higher than at least two-fold dilutions, to at least one of the antifungals tested. We also analyzed the ability of these strains to stimulate cytokine production by human PBMCs. CIM01 and CIM03 Light and Dark isolates showed similar cytokine profiles to the control strain; while CIM02 and CIM04 ones behaved differently (P<0.001), suggesting that differences in the surface of some of the isolates can influence host-fungus interaction. Since S. brasiliensis Light and Dark isolates show disparate phenotypic parameters, it is quite possible that coinfection represents a common occurrence with potential clinical implications on feline sporotrichosis dynamics.
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/11850
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