Please use this identifier to cite or link to this item: https://app.uff.br/riuff/handle/1/13001
Title: Caracterização dos mecanismos de interação do hospedeiro ambiental Acanthamoeba castellanii com fungos patogênicos e seu impacto na virulência fungica
Authors: Gonçalves, Diego de Souza
metadata.dc.contributor.advisor: Guimarães, Allan Jefferson
metadata.dc.contributor.advisorco: Cortines, Juliana Reis
metadata.dc.contributor.members: Meyer, José Roberto
Rizzo, Juliana
Pinto, Marcia Ribeiro
Machado, Ricardo Luiz Dantas
Issue Date: 2019
Abstract: Amebas de vida livre (AVLs) são organismos ubíquos, distribuindo-se desde solos a áreas alagadas. Entretanto, inúmeras espécies de AVLs tem sidos descritas como contaminante de águas de uso humano. AVLs vem sendo relatado como veículos de outros microrganismos, no seu interior, facilitando a outros patógenos acesso a diferentes áreas ou até mesmo a vertebrados superiores. Assim como as AVLs, os fungos são por natureza ubíquotos e por fim acabam coexistindo. Dentre as espécies de AVLs, a Acanthamoeba castellanii (Ac) é a mais caracterizada com relação à sua atividade micofágica. Entretanto, muitas espécies fungicas são capazes de resistir a atividade fagocítica de Ac, permanecendo viáveis em seu interior. A partir desta observação, diversos autores vêm estudando a interação entre esses microrganismos, uma vez que ambos são patógenos em potencial com larga distribuição ecológica. No presente trabalho avaliamos as interações de Ac com fungos, o que pode resultar diretamente na modificação da virulência de espécies fúngicas. Caracterizamos a cinética de interação entre Ac-fungos e sua dependência relacionada a parâmetros, como tempo e multiplicidade de infecção. Investigamos a participação de receptores de superfície, capazes de reconhecer moléculas presentes nas superfícies da parede celular fúngica e facilitar a adesão/entrada destas leveduras aos trofozoítos. Utilizando extratos protéicos biotinilados da membrana de Ac, foram usados relacionados à ligação manose purificada ou presente na superfície fúngica. Como principal ineditismo deste trabalho, identificamos através de espectrometria de massas, duas proteínas de Ac capazes de reconhecer resíduos de manose (MBP, L8WXW7 e MBP1, Q6J288), participando como receptores fúngicos. A partir dos dados obtidos da espectrometria de massas, obtivemos a estrutura molecular tridimensional, tal como o esclarecimento da importância dessa proteína no processo da interação. Como a interação não pode ser inibida completamente, quando inibido os receptores MBP, levantou a hipótese de outros receptores envolvidos no processo de interação Ac-fungos. O reconhecimento do polissacarídeo majoritário na superfície fúngica, β-1,3-glucana, foi uma das evidências encontradas após diferentes análises. O uso da proteína-de-fusão dectina-1-Fc (IgG2b), em conjunto com extratos biotinilados de Ac demonstrou co-localização à paredes celular fúngica, indicando o reconhecimento de β-1,3-glucana por Ac. Foi descrito pela primeira vez, a secreção de vesículas extracelulares por Ac. Caracterizamos a morfologia, composição lipídica e proteica desses vesículas extracelulares (EVs) e a determinação de componentes protéicos na fração não particulada (sobrenadante livre de vesículas) secretadas por Ac. Foi descrito a participação, tanto das EVs como da fração não-particulada, no processo de dano celular causado por Ac. Ensaios de citotoxicidade com linhagens de células animais demonstrou efeito citotóxico do secretoma, capaz de induzir necrose ou apoptose nestas linhagens celulares, respectivamente, deixando clara a importância deste secretoma na patogênese de A.castellanii. Adicionalmente, demonstramos o efeito do secretoma de Ac sobre a virulência das leveduras. O tratamento destes fungos com EVs ou fração particulada do secretoma de Ac, provocou diferentes efeitos sobre a biologia destes fungos como: aumento na taxa de crescimento das leveduras, efeito sobre a transição morfológica (levedura-filamento), aumento na fagocitose pela própria Ac e aumento da virulência quando utilizado as células tratadas com as diferentes frações do secretoma em modelos de infecção fúngica utilizando larvas de Galleria mellonella. Todos os dados obtidos ao longo desta tese demonstram a grande importância da interação ecológica entre Ac e fungos, contribuindo com evidencias de como esta AVL pode exercer a pressão seletiva, aumentando a virulência fúngica a hospedeiros vertebrados superiores.
metadata.dc.description.abstractother: Free-living amoebae (FLAs) are ubiquitous organisms, ranging from soils to flooded areas. However, numerous species of FLAs have been described as a contaminant of water for human use. FLAs have been reported as vehicles of other microorganisms inside, facilitating other pathogens access to different areas or even to higher vertebrates. As FLAs, fungi are by nature ubiquitous and eventually coexist. Among the species of FLAs, Acanthamoeba castellanii (Ac) is the most characterized in relation to its mycophagic activity. However, many fungal species are able to resist the phagocytic activity of Ac, remaining viable in their interior. From this observation, several authors have been studying the interaction between these microorganisms, since both are potential pathogens with wide ecological distribution. In the present work we evaluated the interactions of Ac with fungi, which can directly result in the modification of the virulence of fungal species. We characterize the interaction kinetics between Ac-fungi and their dependence related to parameters, such as time and multiplicity of infection. We investigated the participation of surface receptors capable of recognizing molecules present on fungal cell wall surfaces and facilitating adhesion / entry of these yeasts to trophozoites. Using biotinylated protein extracts from the Ac membrane, they were used related to purified mannose binding or present on the fungal surface. As the main novelty of this work, we identified through mass spectrometry two Ac proteins capable of recognizing mannose residues (MBP, L8WXW7 and MBP1, Q6J288), participating as fungal receptors. From the data obtained from mass spectrometry, we obtained the three - dimensional molecular structure, as well as the clarification of the importance of this protein in the interaction process. As the interaction can not be completely inhibited, when inhibited MBP receptors, raised the hypothesis of other receptors involved in the process of interaction Ac-fungi. The recognition of the major polysaccharide on the fungal surface, β-1,3-glucan, was one of the evidences found after different analyzes. The use of the dectin-1-Fc fusion protein (IgG2b), together with biotinylated extracts of Ac demonstrated co-localization to the fungal cell wall, indicating the recognition of β-1,3-glucan by Ac. It was first described, the secretion of extracellular vesicles by Ac. We characterize the morphology, lipid and protein composition of these exosomes and the determination of protein components in the non - particulate fraction (EVs free supernatant) secreted by Ac. The participation of both EVs and the non-particulate fraction was described in the cellular damage process caused by Ac. Citotoxicity tests with animal cell lines demonstrated a cytotoxic effect of the secretoma, capable of inducing necrosis or apoptosis in these cell lines, respectively, making clear the importance of this secretoma in the pathogenesis of A. castellanii. Additionally, we demonstrated the effect of the Ac secretoma on yeast virulence. The treatment of these fungi with EVs or particulate fraction of the secretoma of Ac caused different effects on the biology of these fungi, such as: increase in yeast growth rate, effect on morphological transition (yeast-hypha), increase in phagocytosis by Ac and increased virulence when using cells treated with different fractions of the secretoma in fungal infection models using Galleria mellonella larvae. All the data obtained during this thesis demonstrate the great importance of the ecological interaction between Ac and fungi, contributing with evidences of how this FLAs can exert the selective pressure, increasing the fungal virulence to superior vertebrate hosts.
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/13001
Appears in Collections:PPGMPA - Teses e Dissertações

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Tese- Diego de Souza Gonçalves. Final.pdf53.68 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.