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Title: O Papel da proteína ASC no metabolismo ósseo associada ao uso de diferentes biomateriais
Other Titles: The role of ASC protein in bone metabolism associated with the use of different biomaterials
Authors: Lorenzi, Suelen Cristina Sartoretto
metadata.dc.contributor.advisor: Granjeiro, José Mauro
metadata.dc.contributor.advisorco: Maia, Mônica Diuana Calasans
Issue Date: 2018
Abstract: Uma das estratégias principais na medicina regenerativa é o preenchimento de defeitos ósseos com materiais biocompatíveis, a fim de otimizar o reparo ósseo funcional. Em particular, as propriedades como osteocondução e bioabsorção são melhoradas pela substituição parcial de CO 3 -2 e PO 3 -2 na hidroxiapatita (HA), um dos materiais mais utilizados mundialmente nas aplicações médicas. No entanto, a implantação de biomateriais pode apresentar reações inflamatórias nos estágios iniciais. Estudos recentes identificaram o papel da proteína ASC como mediador da resposta inflamatória devido ao recrutamento e formação do complexo inflamassoma. Os camundongos nocauteados para a proteína ASC (KO) apresentam resistência a doenças inflamatórias, como a artrite reumatóide e a esclerose múltipla, mas as contribuições da proteína ASC no reparo ósseo e na resposta biológica durante a implantação de biomateriais inorgânicos ainda não foram investigadas. Objetivou-se investigar a função de ASC na deposição de osso de novo avaliando a expressão genética do mRNA dos diferentes genes envolvidos na inflamação e reparo ósseo em resposta a HA, HA contendo carbonato (CHA) ou estrôncio e carbonato (SrCHA). Em seguida, células osteoprogenitoras primárias de camundongos do tipo selvagem/C57BL/6 e ASC KO foram coletadas e expostas aos meios condicionados pelos biomateriais. Através de análise histoquímica a coloração positiva para osteoblastos, fosfatase alcalina (ALP) e para osteoclastos, fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAcP) foram detectadas. Posteriormente, para validar a hipótese de que a ASC regula a diferenciação de osteoblastos e a deposição de osso de novo, camundongos de ambos os genótipos foram submetidos a implantação de HA, CHA e SrCHA na região de subcutâneo e tíbia. A análise semiquatitativa da resposta inflamatória foi avaliada segundo a Norma ISO 10993:6:2016. O processo de reparo ósseo em tíbia foi avaliado através de análises histológica, histomorfométrica e imuno-histoquímica. A microtomografia computadorizada (µCT) foi utilizada para confirmar os dados. Testes de Elisa para identificação de RANKL e BALP circulantes foram realizados. A cultura primária de osteoblastos do grupo ASC KO apresentou níveis menores de ALP quando comparada com as células do tipo selvagem, independente da exposição indireta aos diferentes biomateriais, sugerindo ASC como uma nova proteína envolvida na diferenciação dos osteoblastos in vitro. Os resultados in vivo mostraram que os camundongos ASC KO não foram capazes de curar completamente os defeitos em tíbia aos 28 dias, independente do biomaterial utilizado, enquanto os defeitos da tíbia de tipo selvagem apresentavaram maior volume de osso novo na análise histomorfométrica (p=0.03), confirmado pela marcação de RUNX2. Em conjunto, nossos resultados sugerem fortemente que a deposição de osso de novo é um evento biológico ASC-dependente, que deve ser explorado no campo da bioengenharia óssea.
metadata.dc.description.abstractother: One of the principal strategies in regenerative medicine is to fill bone defects with biocompatible materials in order to support functional bone healing. In particular, properties such as osteoconductivity and bio-absorption are improved by partial substitution of CO 3 -2 and PO 3 -2 in hydroxyapatite (HA), one of the most common materials used globally in medical applications. However, the implantation of biomaterials may present clinical limitations such as inflammatory reactions at the early stages. Recent studies demonstrate the roile of ASC protein as a mediator of the inflammatory response due to the recruitment and formation of the inflammasome complex. Mice knocked out for protein (ASC KO) present resistance to inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis and multiple sclerosis, but the contributions of the ASC protein in the bone repair and biological response to inorganic biomaterials for implanting have not been yet investigated. The objective was to investigate the role of ASC in the bone de novo deposition evaluating the mRNA gene expression of the different genes involved in inflammation and bone healing in response to HA, HA containing carbonate (CHA) or strontium and carbonate (SrCHA). Next, primary osteoprogenitor cells from wild type/C57BL/6 and ASC KO mice both genotypes were collected end exposed to conditioned medium of different biomaterials (HA, CHA and SrCHA). Through histochemical analysis the positive staining for osteoblasts, alkaline phosphatase (ALP) and for osteoclasts, tartrate resistant acid phosphatase (TRAcP) were detected. Subsequently, to validate the hypothesis that ASC protein regulates osteoblast differentiation and the bone de novo deposition, mice from both genotypes were submitted to the implantation of HA, CHA and SrCHA in the subcutaneous and tibia region. The semiquatitative analysis of the inflammatory reaction was evaluated according to ISO 10993: 6: 2016. The healing process of tibia defects was evaluated through histological, histomorphometric and immunohistochemical analysis. Computerized microtomography (µCT) was used to confirm the data. Elisa tests for identification of circulating RANKL and BALP were performed. The primary culture of osteoblasts from the ASC KO group showed lower levels of ALP when compared to wild type cells, independent of indirect exposure to different biomaterials, suggesting ASC as a novel protein involved in the differentiation of osteoblasts in vitro. The set of in vivo results showed that the ASC KO mice were not able to complete the healing of tibia defects at 28 days, regardless of the biomaterial used, whereas the defects in tibia of wild type group presented a larger volume of new bone formation in histomorphometric analysis (p=0.03) that was confirmed by RUNX2. Overall, our results strongly suggest that de novo bone deposition is an ASC-dependent biological event, which should be explored in the field of bone bioengineering.
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/14276
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