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Title: Estudo dos efeitos causados pela deleção de genes relacionados ao biofilme de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) in vitro e sobre a virulência em modelo experimental de roedores
Authors: André, Lialyz Soares Pereira
metadata.dc.contributor.advisor: Alves, Fábio Aguiar
metadata.dc.contributor.advisorco: Pereira, Renata Freire Alves
metadata.dc.contributor.members: Penna, Bruno de Araújo
Póvoa, Helvécio Cardoso
Pinheiro, Marcos Gabriel
Issue Date: 2020
Abstract: Introdução: Staphylococcus aureus é um dos principais agentes de infecções nosocomiais e comunitárias, sendo de grande importância clínica. A adesão e consequente formação de biofilme em dispositivos médicos e tecidos do hospedeiro, desempenham um importante papel nas infecções crônicas. Além disso, a emergência de diversos clones de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA), torna esse patógeno um desafio ainda maior para a terapêutica atual, tal como o clone de MRSA USA 300 (ST8-SCCmec IV-PVL+), que foi inicialmente associado à comunidade e se tornou uma estirpe responsável por causar epidemias em todo o mundo. Diversas estratégias têm sido utilizadas para desativar genes específicos, a fim de determinar os efeitos desses genes na função dos microrganismos. Sendo assim, o entendimento dos mecanismos que coordenam a formação dos biofilmes estafilocócicos, como por exemplo, o gene atl que codifica uma autolisina com um papel comprovado na divisão celular bacteriana, é de grande relevância. Objetivo: avaliar, através de ensaios in vitro e in vivo, a importância dos genes que controlam a expressão das proteínas que compõem a superfície microbiana e reconhecem moléculas de adesão da matriz (MSCRAMMs) e de outros genes relacionados com a formação e/ou manutenção dos biofilmes. Material e Métodos: foram realizados ensaios in vitro com o objetivo de avaliar a capacidade de formação dos biofilmes e a Microscopia Eletrônica de Varredura das estirpes selvagem e mutantes selecionadas para o estudo. Em seguida, foi realizado um modelo de sepse com 14 grupos (12 mutantes, 1 selvagem e 1 controle negativo) de 6 camundongos para a avaliação de sobrevida, macroscopia e peso dos órgãos, colonização tecidual, hemograma e bioquímica. Finalmente, foi realizado um modelo de implantação de cateteres no dorso dos camundongos, com a inoculação de uma suspensão bacteriana contendo as diferentes estirpes do estudo. Foi avaliada a macroscopia do dorso dos camundongos e os cateteres foram explantados e processados para a contagem de UFC. Resultados: No ensaio de força do biofilme, a estirpe Δatl demonstrou produção mais intensa de biofilme em relação às outras estirpes do estudo, incluindo a estirpe selvagem. A Microscopia Eletrônica de Varredura revelou que o biofilme formado pela estirpe selvagem apresentou um número muito reduzido de células e a presença de muitas células isoladas nos campos, enquanto no biofilme formado pela cepa Δatl, as células estavam intimamente aderidas e em maior número. No modelo de sepse, apenas o baço da maioria das estirpes apresentou uma diferença significativa de peso em relação ao grupo controle negativo. Não houve diferença na colonização dos órgãos entre os grupos inoculados com as estirpes selecionadas para este estudo. O experimento de sobrevida demonstrou que 100% dos camundongos inoculados com a estirpe Δatl morreram nas primeiras 20 horas após a infecção. As análises bioquímicas comprovaram um quadro de insuficiência renal e hepática, com aumento significativo na avaliação dos níveis séricos de GGT apenas para o grupo inoculado com a estirpe Δatl. O modelo de cateter demonstrou que a estirpe Δatl causou lesões de maior gravidade no dorso dos animais, interessantemente, as contagens das bactérias não revelaram diferenças significativas entre os grupos estudados. Conclusão: O biofilme formado pela estirpe Δatl apresentou produção mais intensa em comparação com as outras estirpes mutantes e a estirpe selvagem nos ensaios in vitro e apresentou um importante aumento da virulência no experimento de sepse e implantação de cateteres, por isso novos estudos sobre os mecanismos de patogenicidade dessa estirpe mutante precisam ser realizados.
metadata.dc.description.abstractother: Introduction: Staphylococcus aureus is a major cause of nosocomial and community-acquired infections, being of great clinical importance. Adhesion and consequent biofilm formation in medical devices and host tissues play an important role in chronic infections. In addition, the emergence of several methicillin-resistant S. aureus (MRSA) clones makes this pathogen an even greater challenge for current therapy, such as the MRSA USA 300 clone (ST8-SCCmec IV-PVL +), initially associated with the community and has become a strain responsible for causing epidemics worldwide. Several strategies have been used to disable specific genes in order to determine the effects of these genes on the function of microorganisms. Thus, the understanding of the mechanisms that coordinate the formation of staphylococcal biofilms, such as the atl gene that encodes an autolysin with a proven role in bacterial cell division, is of great relevance. Objective: To evaluate, through in vitro and in vivo assays, the importance of genes that control the expression of proteins that make up the microbial surface and recognize matrix adhesion molecules (MSCRAMMs) and other genes related to formation and / or maintenance of biofilms. Material and Methods: In vitro assays were performed in order to evaluate the biofilm formation capacity and Scanning Electron Microscopy of wild and mutant strains selected for the study. Subsequently, a sepsis model with 14 groups (12 mutants, 1 wild and 1 negative control) of 6 mices was performed to assess survival, macroscopy and organ weight, tissue colonization, blood count and biochemistry. Finally, a model of catheter implantation in the back of the mice was performed, with the inoculation of a bacterial suspension containing the different strains of the study. Macroscopy of the back of the mice was evaluated and the catheters explanted and processed for CFU counting. Results: In the biofilm strength test, the Δatl strain demonstrated more intense biofilm production compared to the other study strains, including the wild strain. Scanning Electron Microscopy revealed that the biofilm formed by the wild strain had a very small number of cells and the presence of many isolated cells in the fields, while in the biofilm formed by the Δatl strain, the cells were closely adhered and in larger numbers. In the sepsis model, only the spleen of most strains showed a significant weight difference compared to the negative control group. There was no difference in organ colonization between the groups inoculated with the strains selected for this study. The survival experiment showed that 100% of mice inoculated with the Δatl strain died within the first 20 hours after infection. Biochemical analyzes showed renal and hepatic insufficiency, with a significant increase in the evaluation of serum GGT levels only for the group inoculated with the Δatl strain. The catheter model showed that the Δatl strain caused more severe injuries to the back of the animals. Interestingly, the bacterial counts did not reveal significant differences between the groups studied. Conclusion: The biofilm formed by the Δatl strain showed more intense production compared to the other mutant strains and the wild strain in the in vitro assays and showed a significant increase of virulence in the sepsis and catheter implantation experiment, therefore new studies on the mechanisms pathogenicity of this mutant strain need to be performed.
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/15807
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