Diagnóstico diferencial da infecção pelo vírus zika e outras arboviroses: produção de proteínas recombinantes com potencial antigênico para o desenvolvimento de métodos imunológicos

Abstract

Introdução: O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus da família Flaviviridae que causa infecções assintomáticas e sintomáticas. O diagnóstico clínico das arboviroses é dificultado nas áreas com cocirculação do ZIKV, Dengue (DENV) e Chikungunya (CHIKV) e, assim, a confirmação laboratorial baseada na resposta imunológica do hospedeiro é importante, principalmente para gestantes. Hipótese(s) Científica(s): A utilização de proteínas específicas do ZIKV, através da tecnologia recombinante de produção de proteínas, permitirá o desenvolvimento de metodologia sensível e específica no diagnóstico diferencial das principais arboviroses que infectam o ser humano. Objetivo Geral: Produção de proteínas recombinantes virais e desenvolvimento de métodos imunológicos para o diagnóstico diferencial da infecção pelo vírus Zika e outras arboviroses. Objetivo(s) Específico(s): Produzir proteínas recombinantes virais de interesse através de expressão heteróloga utilizando a tecnologia do DNA sintético; avaliar a antigenicidade e imunogenicidade das proteínas expressas frente a amostras de referência de cada um desses vírus, desenvolvimento e padronização de métodos para o diagnóstico diferencial através da detecção de antígenos e anticorpos utilizando as técnicas de ELISA e LUMINEX e avaliar a sensibilidade e especificidade dos métodos imunológicos previamente padronizados utilizando amostras clínicas de pacientes infectados com arbovírus. Material e Métodos: Foram analisadas a antigenicidade e imunogeniciadde in silico das sequências de aminoácidos das proteínas recombinantes. Para padronizar e avaliar os ensaios, foram utilizados soros da soroteca do Laboratório de Diagnóstico Imunológico e Molecular das Doenças Infecciosas e Parasitárias do Instituto de Microbiologia Paulo Góes (UFRJ), que foram testados previamente por RT-PCR para ZIKV, DENV e CHIKV. Foram expressas quatro proteínas parciais recombinates do ZIKV (Envelope, NS3 e NS5) com calda de histidina em seu N-terminal com a utilização de DNA sintético otimizando a sequência gênica. Após expressão, essas proteínas foram purificadas em colunas de níquel por cromatografia de afinidade. O método de ELISA indireto para detecção de IgG foi padronizado utilizando essas proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos das proteínas de Envelope e NS1 no diagnóstico do ZIKV, através da detecção de anticorpos em amostras clínicas. Também foi padronizado um método multiplex (LUMINEX) para diagnóstico do ZIKV utilizando a proteína recENV. Resultados: As análises in silico mostraram que todas as proteínas recombinantes possuem sítios antigênicos. Foi observado uma maior expressão da proteína recNS5, NS31 e 2 em extrato solúvel e da proteína recENV de ZIKV no insolúvel e elas apresentaram peso molecular de aproximadamente 28 kDa, 25 kDa, 25 kDa e 30 kDa, respectivamente. Após sequenciamento por espectrometria de massas, foram comprovadas as sequências corretas das mesmas, com exceção da recNS5 ZIKV, mas com contaminação por peptídeos de E. coli e uma segunda expressão da recENV foi realizada. Um teste ELISA foi padronizado utilizando a segunda recENV ZIKV expressa e uma sensibilidade de 67% e uma especificidade de 96% foi observada. Um estudo de cinética de anticorpos IgM e IgG foi realizado utilizando soros de 8 pacientes em acompanhamento, que mostraram na sua maioria, uma producao esperada de anticorpos. Três peptídeos de ENV ZIKV e um de NS1 ZIKV, apresentaram imunoreatividade quando testados com amostras positivas para ZIKV, DENV e controle negativo. Um teste multiplex Luminex foi realizado utilizando a proteína recENV ZIKV e apresentou diferenciação de soros positivos dos negativos