Resistência aos carbapenêmicos em cepas de pseudomonas aeruginosa ST2236 e ST2237 não produtoras de carbapenemases

Abstract

Pseudomonas aeruginosa é um dos microrganismos mais frequentes em infecções nosocomiais, afetando principalmente pacientes imunocomprometidos. Altas taxas de mortalidade estão associadas à capacidade desse patógeno de desenvolver resistência antimicrobiana. Os carbapenêmicos são a primeira escolha para o tratamento de infecções por P. aeruginosa MDR. A resistência aos carbapenêmicos está frequentemente associada à hidrólise enzimática por carbapenemases. No entanto, na ausência de carbapenemases, outros mecanismos estão envolvidos, como perda da proteína OprD, superexpressão de bombas de efluxo e/ou AmpC. Este estudo teve como objetivo investigar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos (imipenem e meropenem) em cepas de P. aeruginosa não produtoras de carbapenemases, pertencentes a dois tipos clonais: ST2236 e ST2237. Cinco cepas resistentes aos carbapenêmicos (CR), uma cepa resistente somente ao imipenem (IR) e cinco suscetíveis aos carbapenêmicos (CS), coletadas de pacientes queimados e tanques de balneoterapia, foram analisadas neste estudo. A CIM, para imipenem e meropenem, foi determinada pelo teste epsilométrico e microdiluição em caldo. A cepa de P. aeruginosa ATCC27853 foi usada como controle em ambos os testes. Mutações no gene oprD foram investigadas em cinco cepas CR, uma IR e uma CS, por PCR, seguido de sequenciamento. A análise das sequências foi realizada por Lasergene Software e comparada com a cepa de referência PAO1. Os níveis transcricionais dos genes: mexA, mexX, mexC, mexE, oprD e ampC foram analisados por RT-qPCR para todas as cepas CR e IR (com e sem indução por imipenem) e todas CS. A cepa PAO1 foi utilizada como referência neste teste. A detecção fenotípica de superexpressão de efluxo e AmpC, foi avaliada pela redução da CIM na presença dos inibidores: PAβN e cloxacilina, respectivamente. As cepas CR apresentaram níveis moderados de resistência em ambos os testes de CIM para os carbapenêmicos avaliados. Apenas a cepa 24 (IR) foi suscetível ao meropenem. O sequenciamento do gene oprD revelou mutações pontuais e de deleções e inserções, com padrões de mutação semelhantes em cepas do mesmo ST. Nenhuma mutação de deleção ou inserção foi detectada no gene oprD das cepas ST2236 (3, 24 e 26); apenas substituições de pares de bases. No entanto, um códon de parada prematuro foi detectado apenas nas cepas resistentes deste ST (3 e 24). Mutações no gene oprD foram particularmente impactantes nas cepas ST2237 (2, 4, 5 e 31), uma vez que mutações de deleções e inserções foram detectadas. A não detecção de transcritos de oprD por RT-qPCR, confirma a ausência de porina nas cepas ST2237. Baixos níveis transcricionais foram detectados para oprD, incluindo a cepa 26 (CS). Apenas o sistema de efluxo MexXY-OprM foi superexpresso nas cepas CR e IR. Entretanto, o teste fenotípico não detectou superexpressão de efluxo e de AmpC. Níveis transcricionais elevados de ampC (>10X) foram encontrados em 50% das cepas resistentes não induzidas. Todas as cepas CR e IR induzidas mostraram um aumento na expressão de ampC (103X >PAO1). Conclui-se que, a redução e/ou perda de OprD associada à superexpressão de AmpC provavelmente é o principal mecanismo de resistência aos carbapenêmicos nas cepas avaliadas; e que a superexpressão de MexXY-OprM pode ter contribuído para esse fenótipo de resistência.