Papel filtro como alternativa de coleta de urina na doença de Pompe: desenvolvimento do método para determinação do tetrassacarídeo de glicose e busca por novos biomarcadorres

Abstract

A doença de Pompe é um erro inato do metabolismo caracterizada pelo acúmulo intralisossomal de glicogênio devido à deficiência da enzima α-glicosidase ácida. É uma patologia rara, que pode levar o indivíduo ao óbito logo nos primeiros anos de vida. Dentre os métodos de diagnósticos e ensaios laboratoriais auxiliares já conhecidos, a determinação do biomarcador não-seletivo tetrassacarídeo de glicose (Glc4) por cromatografia a líquido em urina é utilizada como teste secundário e não invasivo na avaliação inicial de um indivíduo com a suspeita da doença. Tal abordagem também é bastante utilizada no monitoramento dos níveis de Glc4 na urina do paciente já diagnosticado e submetido à terapia de reposição enzimática, de modo a avaliar a eficácia da intervenção terapêutica. Contudo, o envio das amostras de urina dos pacientes para o laboratório clínico, quando necessário, é bastante custoso, demorado e crítico, uma vez que essas amostras devem ser necessariamente mantidas sob refrigeração. Dessa forma, foi desenvolvido neste trabalho um kit para coleta da urina em papel filtro para a determinação de Glc4 por LC-HRMS. Este kit permitirá que os usuários coletem a urina em papel de filtro em sua própria casa e enviem para o laboratório via correios em envelope convencional e em temperatura ambiente. Para o emprego da metodologia, 1 mL de urina foi adicionada sobre o papel filtro disposto em uma caixa de plástico (6,0 x 3,0 cm). Após a secagem à temperatura ambiente por 24 h, a extração foi realizada com uma mistura de ACN:H2O (1:1, %v/v) contendo 0,1% de NH4OH sob agitação por 15 min. O extrato foi centrifugado e analisado por LC-HMRS, utilizando experimentos de aquisição de dados de análise alvo para a determinação do Glc4 combinado com análise global para a busca de novos biomarcadores. O método desenvolvido para o Glc4 foi validado e apresentou faixa linear compreendida entre 1-20 μg/mL, LQ de 0,03μg/mL, repetibilidade < 5,11% (n = 9) e recuperação de 96 ± 3,59% em três níveis de concentrações. A metodologia utilizando a urina seca foi confrontada com aquela já estabelecida para a determinação do Glc4 em urina in natura, na qual a estatística de Bland-Altmann confirmou a existência de uma boa relação entre as mesmas (bias: -0,1429; limite de concordância de 95%: -3,001- 2,716). O estudo de estabilidade permitiu verificar a degradação do Glc4, bem como dos demais metabólitos presentes na urina seca a partir do sétimo dia a 4 e 22 °C, e a partir do terceiro dia a 50 ºC. Dados da literatura mostram uma estabilidade de apenas 24 h para urina in natura a 4 e 22 °C. As análises estatísticas multivariadas empregadas para o tratamento de dados de análise global como PCA, PLS-DA, Random Forest e Curva ROC, revelaram diferenças metabólicas entre o grupo Pompe e o controle. O conjunto de potenciais biomarcadores encontrados aumentou a predição na classificação das amostras, assumindo um grande passo para o desenvolvimento de futuros testes de triagem mais específicos e de fácil acesso utilizando urina coletada em papel filtro para a doença de Pompe.