PAPEL FILTRO COMO ALTERNATIVA DE COLETA DE URINA NA DOENÇA DE POMPE: DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DO TETRASSACARÍDEO DE GLICOSE E BUSCA POR NOVOS BIOMARCADORRES
Doença rara
Erro inato do metabolismo
Kit
Urina
Papel filtro
Tetrassacarídeo de glicose
LC-HRMS
Biomarcadores
Biomarcador diagnóstico
Glucosa tetrasacárido
Deficiência de enzimas
Doença genética
Composto químico
Fibra muscular
Metabolismo
Cromatografia a líquido de alta eficiência
Espectrometria de massa com acelerador
Pompe disease
Rare disease
Inborn error of metabolism
Kit
Urine
Filter paper
Glucose tetrasaccharide
LC-HRMS
Biomarkers
Abstract
A doença de Pompe é um erro inato do metabolismo caracterizada pelo acúmulo
intralisossomal de glicogênio devido à deficiência da enzima α-glicosidase ácida. É
uma patologia rara, que pode levar o indivíduo ao óbito logo nos primeiros anos de
vida. Dentre os métodos de diagnósticos e ensaios laboratoriais auxiliares já
conhecidos, a determinação do biomarcador não-seletivo tetrassacarídeo de
glicose (Glc4) por cromatografia a líquido em urina é utilizada como teste secundário
e não invasivo na avaliação inicial de um indivíduo com a suspeita da doença. Tal
abordagem também é bastante utilizada no monitoramento dos níveis de Glc4 na
urina do paciente já diagnosticado e submetido à terapia de reposição enzimática,
de modo a avaliar a eficácia da intervenção terapêutica. Contudo, o envio das
amostras de urina dos pacientes para o laboratório clínico, quando necessário, é
bastante custoso, demorado e crítico, uma vez que essas amostras devem ser
necessariamente mantidas sob refrigeração. Dessa forma, foi desenvolvido neste
trabalho um kit para coleta da urina em papel filtro para a determinação de Glc4 por
LC-HRMS. Este kit permitirá que os usuários coletem a urina em papel de filtro em
sua própria casa e enviem para o laboratório via correios em envelope convencional
e em temperatura ambiente. Para o emprego da metodologia, 1 mL de urina foi
adicionada sobre o papel filtro disposto em uma caixa de plástico (6,0 x 3,0 cm).
Após a secagem à temperatura ambiente por 24 h, a extração foi realizada com
uma mistura de ACN:H2O (1:1, %v/v) contendo 0,1% de NH4OH sob agitação por
15 min. O extrato foi centrifugado e analisado por LC-HMRS, utilizando
experimentos de aquisição de dados de análise alvo para a determinação do Glc4
combinado com análise global para a busca de novos biomarcadores. O método
desenvolvido para o Glc4 foi validado e apresentou faixa linear compreendida entre
1-20 μg/mL, LQ de 0,03μg/mL, repetibilidade < 5,11% (n = 9) e recuperação de 96
± 3,59% em três níveis de concentrações. A metodologia utilizando a urina seca foi
confrontada com aquela já estabelecida para a determinação do Glc4 em urina in
natura, na qual a estatística de Bland-Altmann confirmou a existência de uma boa
relação entre as mesmas (bias: -0,1429; limite de concordância de 95%: -3,001-
2,716). O estudo de estabilidade permitiu verificar a degradação do Glc4, bem como
dos demais metabólitos presentes na urina seca a partir do sétimo dia a 4 e 22 °C,
e a partir do terceiro dia a 50 ºC. Dados da literatura mostram uma estabilidade de
apenas 24 h para urina in natura a 4 e 22 °C. As análises estatísticas multivariadas
empregadas para o tratamento de dados de análise global como PCA, PLS-DA,
Random Forest e Curva ROC, revelaram diferenças metabólicas entre o grupo
Pompe e o controle. O conjunto de potenciais biomarcadores encontrados
aumentou a predição na classificação das amostras, assumindo um grande passo
para o desenvolvimento de futuros testes de triagem mais específicos e de fácil
acesso utilizando urina coletada em papel filtro para a doença de Pompe.
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Document type
TeseSource
SOUZA, Hygor Marcos Ribeiro de. Papel filtro como alternativa de coleta de urina na doença de Pompe: desenvolvimento do método para determinação do tetrassacarídeo de glicose e busca por novos biomarcadorres. 2022. 156 f. Tese (Doutorado em Química) – Programa de Pós-Graduação em Química, Instituto de Química, Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2022.Subject(s)
Doença de PompeDoença rara
Erro inato do metabolismo
Kit
Urina
Papel filtro
Tetrassacarídeo de glicose
LC-HRMS
Biomarcadores
Biomarcador diagnóstico
Glucosa tetrasacárido
Deficiência de enzimas
Doença genética
Composto químico
Fibra muscular
Metabolismo
Cromatografia a líquido de alta eficiência
Espectrometria de massa com acelerador
Pompe disease
Rare disease
Inborn error of metabolism
Kit
Urine
Filter paper
Glucose tetrasaccharide
LC-HRMS
Biomarkers