Desenvolvimento de Métodos por CLAE para o Monitoramento da Atividade da Enzima 5’-deoxi-5’-Metiltioadenosina Fosforilase de Schistosoma Mansoni.

Abstract

A esquistossomose, causada pelo parasita Schistosoma mansoni, é uma doença tropical negligenciada, cujo tratamento se encontra limitado a poucos fármacos considerados ineficientes e associados a efeitos colaterais adversos. A busca por novas alternativas terapêuticas motivou o estudo de inibidores enzimáticos como estratégia potencial. Neste trabalho, desenvolveu-se um método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção ultravioleta (CLAE-UV) para o monitoramento da atividade catalítica da enzima 5’-deoxi-5’-metiltioadenosina fosforilase (SmMTAP). O método analítico foi validado avaliando-se linearidade, precisão, exatidão, seletividade e limites de detecção e quantificação, em conformidade com a legislação vigente. Então, a enzima SmMTAP foi expressa, purificada e imobilizada covalentemente em dois diferentes suportes sólidos: capilares de sílica fundida e nanopartículas magnéticas. No entanto, os reatores em sílica fundida apresentaram atividade muito baixa, mesmo após sucessivas otimizações. Já a enzima SmMTAP imobilizada em nanopartículas magnéticas (MNP@SmMTAP) apresentou atividade cerca de 5 vezes maior que o capilar, além capacidade de reter cerca de 50% de sua atividade inicial por até 14 dias. Ensaios de reusabilidade indicaram manutenção de 50% da atividade inicial até o quinto ciclo reacional, com uma queda gradual a 25% após sete ciclos. Além disso, apresentou constante de Michaelis-Menten cerca de 10 vezes maior que o descrito pela literatura para a enzima livre. Desta forma, a abordagem inovadora de imobilização da SmMTAP em nanopartículas magnéticas viabilizou o desenvolvimento de um ensaio de quantificação direta de adenina, em um sistema capaz de reaproveitar a capacidade catalítica da enzima por período determinado. Esta abordagem pode, portanto, contribuir significativamente para a pesquisa de novos fármacos contra a esquistossomose, ao permitir a identificação de compostos inibidores da SmMTAP de forma precisa e eficiente.