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Title: Diagnóstico diferencial do complexo E. histolytica/ E. dispar por Multiplex-PCR e PCR Tempo Real em amostras de fezes
Authors: Gomes, Thiago dos Santos
metadata.dc.contributor.advisor: Peralta, Regina Helena Saramago
metadata.dc.contributor.advisorco: Peralta, José Mauro
metadata.dc.contributor.members: Gonçalves, Margareth Maria Lessa
Sodré, Fernando Campos
Issue Date: 2-Jan-2018
Abstract: O gênero Entamoeba tem grande importância médica entre os protozoários que parasitam o homem, compreendendo várias espécies que são morfologicamente indistinguíveis através da microscopia óptica. No entanto, a espécie considerada capaz de causar doença, Entamoeba histolytica, era anteriormente considerada uma única espécie que compreendia cepas patogênicas e cepas não-patogênicas. Recentemente, evidências suficientes foram encontradas reclassificando esse protozoário em duas espécies morfologicamente idênticas: a potencialmente patogênica E. histolytica e a não-patogênica E. dispar. Essa reclassificação trouxe a necessidade de se reavaliar a epidemiologia da amebíase, devido à alta freqüência de E. dispar, sendo considerada como E. histolytica. Devido a isso, atualmente quando na microscopia óptica observa-se o cisto característico, o mesmo é considerado do complexo E. histolytica/E.dispar. Dependendo da forma evolutiva e das condições em que se encontre, a E. histolytica pode habitar determinados meios: o intestino seguindo seu ciclo biológico, o cisto permanecendo no solo ou água durante algum tempo após ser eliminado em fezes moldadas, ou nos tecidos ao desenvolver a doença invasiva. O diagnóstico laboratorial da amebíase na rotina dos laboratórios clínicos é baseado no exame parasitológico de fezes, no qual é realizada a pesquisa de formas evolutivas de E. histolytica, E. dispar, E. moshkovskii e E. hartmanni. No entanto, essa técnica não é capaz de identificar entre essas espécies morfologicamente semelhantes de E. histolytica, dando ao método um caráter mais sugestivo do que diagnóstico. Por isso, cada vez mais ensaios moleculares, como o ELISA para detecção de antígeno ou anticorpo e como a PCR para detecção de DNA, são descritos na busca de fornecer métodos diagnósticos mais sensíveis, específicos e rápidos. Neste estudo foram avaliadas as técnicas de Multiplex-PCR e PCR Tempo Real no diagnóstico diferencial entre E. histolytica e E. dispar em amostras, provenientes de moradores do projeto de assentamento Frei Vantuy da cidade de São Jorge de Ilhéus na Bahia, diagnosticadas como positivas pelo exame parasitológico de fezes (EPF). Pela Multiplex-PCR, seis entre 24 amostras que eram consideradas positivas para o complexo E. histolytica/E. dispar pelo EPF, foram diagnosticadas como positivas para E. dispar e nenhuma para E. histolytica. Pela PCR Tempo Real, uma amostra foi positiva para E. histolytica e 13 amostras foram positivas para E. dispar. A técnica de Multiplex-PCR apresenta uma boa sensibilidade e especificidade, no entanto, o PCR Tempo Real detectou DNA em um número maior de amostras. Uma hipótese levantada para este resultado seria o baixo rendimento do processo de extração de DNA, com concentrações de DNA abaixo inclusive do limite de detecção do Multiplex-PCR, mas possível pela PCR Tempo Real por ser um método muito mais sensível. Quanto aos resultados negativos, eles podem indicar resultados falso-positivos pela microscopia ou, também, a presença de infecções por outras espécies de amebas morfologicamente semelhantes, por isso não sendo identificadas pelo método utilizado no estudo, visto que foram utilizados apenas iniciadores específicos para a amplificação de seqüências das espécies E. histolytica e E. dispar.
metadata.dc.description.abstractother: The genus Entamoeba has importance among the protozoans capable of causing infection in humans, comprising many species that are morphologically indistinguishable by microscopy. However, the species known as capable of causing disease is Entamoeba histolytica which was considered for a long time as only one specie with two strains, one pathogenic and another non-pathogenic. Recently, enough evidences were found showing the need of rename this protozoan into two species morphologically identical: the potentially pathogenic E. histolytica and the non-pathogenic E. dispar. This reclassification brought the need of evaluate the epidemiology of amoebiasis, because of the high prevalence of E. dispar, a species that were considered as E. histolytica previously. Nowadays, when the cyst is found by microscopy, the parasite is classified as belong to E. histolytica/ E. dispar complex, because it is impossible to differentiate the species only by this method. In the biological cycle, E. histolytica can habitat different environments: intestine, water and soil, where it maintain alive during some time after its elimination within the feces, or in the human tissues where it develop the invasive disease. Laboratorial diagnosis of amoebiasis in clinical labs is based in the microscopy, searching for Entamoeba histolytica, E. dispar, E. moshkovskii and E. hartmanni morphological characteristics. However, this method did not allow differentiating this species of the parasite, thus its results are more a suggestion than a diagnosis. As a consequence of this lack of specificity and the low sensitivity of microscopy examination, new assays as ELISA for antigen or antibody detection and PCR for detection of DNA are described, showing an effort in providing more sensitive, more specific and faster diagnostic methods. In this study we evaluated a multiplex-PCR and the real time PCR in samples from residents of Frei Vantuy in São Jorge de Ilhéus (Bahia, Brazil) considered positive to the complex by microscopy in order to differentiate E. histolytica from E. dispar. Among the 24 stool samples diagnosed as positive to the E. histolytica/E. dispar complex, six of these samples were diagnosed as positive to E. dispar by the Multiplex-PCR, but none of the samples were positive for E. histolytica. However, one stool sample was diagnosed as positive to E. histolytica and others 13 samples were diagnosed as positive to E. dispar by real time PCR. The Multiplex-PCR is a sensitive and specific method, but the higher detection by the real time PCR leaded to suspect of a low income of the DNA extraction method, resulting in such a low concentration of DNA that the Multiplex-PCR could not detect, but the Real Time PCR could do it because of its higher sensitivity. And negative results can indicate the presence of infection by other amoeba species morphologically identical to the E. histolytica and E. dispar.
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/5409
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