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Title: Inovações metodológicas para o estudo de parasitos em amostras da megafauna e de outros animais encontrados em sítios arqueológicos e paleontológicos do Brasil
Authors: Cascardo, Paula
metadata.dc.contributor.advisor: Leles, Daniela
metadata.dc.contributor.members: Figueiredo, Beatriz Brener de
Goulart, Patricia Riddell Millar
Sianto, Luciana
Sudré, Adriana Pitella
Chame, Marcia
Issue Date: 2017
Publisher: Universidade Federal Fluminense
Abstract: O Brasil possui grande potencial para pesquisa paleoparasitológica com amostras antigas de animais incluindo os extintos, sendo a América do Sul o continente que mais perdeu espécies com a última grande extinção, da megafauna, que ocorreu no quaternário. O objetivo deste trabalho foi fazer uma revisão sobre parasitos encontrados em animais extintos e, pesquisá-los nas amostras antigas de animais provenientes de sítios arqueológicos e paleontológicos do Brasil por diferentes métodos diagnósticos. Por imunocromatografia e/ou detecção molecular pela PCR (Polymerase Chain Reaction) e sequenciamento nucleotídico foram estudados coprólitos de felinos (n=11), roedores (n=7), canídeo (n=1), preguiça terrícola (n=1), palaeolama (n=2) e amostras ósseas de uma mesma preguiça terrícola (n=5), as amostras tem origem nos estados da Bahia, Piauí e Pernambuco, com datações que vão do Pleistoceno superior até 400±50 antes do presente. Além da pesquisa para alvos moleculares do hospedeiro pesquisou-se também, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Giardia duodenalis e triatomíneos. Nem todos os alvos ou agentes etiológicos foram pesquisados em todas as amostras. Alguns alvos tanto para hospedeiro quanto parasitos foram previamente testados em modelos experimentais, os quais também envolveram a pesquisa de outros organimos como Eimeria sp. e Pentatrichomonas sp. Foram realizados modelos experimentais para padronização dos ensaios imunocromatográficos para pesquisa de T. gondii e G. duodenalis que posteriormente foram testados em algumas amostras antigas. Adicionalmente buscou-se alternativas para o reaproveitamento de amostras verificando a viabilidade do uso de uma mesma alíquota de amostra nas duas técnicas abordadas: imunocromatografia e PCR. A revisão de literatura mostrou que o estudo de parasitos com animais extintos ainda está aquém daqueles realizados com amostras humanas, e essa diferença é ainda maior quando considerado o diagnóstico imunológico e molecular, prevalecendo os estudos por microscopia. Não foi obtido nenhum resultado positivo para os agentes etiológicos pesquisados nas amostras antigas pelo diagnóstico molecular. Porém um dos primers utilizados para T. cruzi em amostras de osso de preguiça terrícola geraram sequências compatíveis com bactérias (Pseudomonas putida, Bradyrhizobium diazoefficiens e Nitrobacter hamburguensis) que podem ser autóctones ou contaminação desde a retirada da amostra do sítio e chegada ao laboratório para análises. Para oalvo triatomíneo com um coprólito de felino conseguiu-se uma sequência de alta qualidadeque não teve similaridade com nenhum organismo com sequência disponibilizada peloGenbank, mostrando a importância do depósito de sequências ainda desconhecidas. O testeimunocromatográfico para T. gondii não se mostrou positivo para amostras antigas, porémmostrou-se promissor com o modelo experimental. Quanto ao teste imuncromotográfico paraG.duodenalis ele foi sensível a diferentes genótipos, humanos, animais ou zoonóticos, tendosido eficiente em todos os modelos experimentais e positivo em duas amostras antigas:coprólitos de preguiça terrícola e palaeolama do mesmo sítio, mostrando a presença desseprotozoário desde o pleistoceno superior no nordeste brasileiro. Com este estudo obteve-se umaimportante inovação metodológica ao mostrar que é possível reaproveitar o resíduo da amostraque passou pelo processo de extração do DNA no teste imunocromatográfico e vice-versa, degrande valor para análise de espécimes raros, como é o caso dos paleoparasitológicos.
metadata.dc.description.abstractother: Brazil has great potential for paleoparasitological research with anciet samples of animals including the extinct ones, with South America being the continent that lost most species at the last great megafauna extinction that occurred in the quaternary. The aim of this work was to make a review about parasites found in extinct animals and investigate them in the ancient remains of animals recovered from archeological and paleontological sites in Brazil by different diagnostic methods.Were analysed by imunocromatography and/or molecular detection though PCR (Polymerase Chain Reaction) and nucletotide sequencing coprolites from felines (n=11), rodents (n=7), canids (n=1), ground sloth (n=1), palaeolama (n=2) and bone samples from another ground sloth (n=5). The samples originate in the states of Bahia, Piauí and Pernambuco, and dated from the late Pleistocene to 400±50 before present. In addition to the research for the molecular targets from the hosts also were studed Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Giardia duodenalis and triatomines, nor the targets nor etiologic agents were studed in all samples. Some targets for the host and also for parasites were previously tested in experimental models, that also involved other organisms such as Eimeria sp. and Pentatrichomonas sp. There were also made experimental models for the padronization os the imunocromatographic tests to the research of T. gondii and G. duodenalis that were than tested in some ancient samples. Aditionaly alternatives were considered for the reuse of the samples verifying the viability of testing the same one in bouth techiniques: imunocromatography and PCR. The literature review showed that the paleoparasitological research from extinct animals are still far from the ones for human samples, and this diference is greater when immunological and molecular diagnosis are considered, prevailing the microscopy. No positive result were obtained with the ancient samples for the etiological agents using the molecular metode. However one of the primers used for T. cruzi inground sloth bone samples generated sequences compatible with bacteria (Pseudomonas putida,Bradyrhizobium diazoefficiens andNitrobacter hamburguensis)which may be autochthonous or contaminated from the withdrawal of the sample from the site and arrival at the laboratory for analysis.For the triatomine target with a feline coprolite a high quality sequence was obtained which had no similarity to any organism with sequence available from Genbank, showing the importance of depositing sequences as yet unknown.The immunochromatographic test for T. gondii did not prove positive for old samples, but it was promising with the experimental model. As for the immunochromatographic test for G. duodenalis, it was sensitive to different genotypes, human, animal or zoonotic, having been efficient in all experimental models and positive in two ancient samples: coprólitos of ground sloth and palaeolama of the same site.With this study, an important methodological innovation was obtained by showing that it is possible to reuse the sample residue that underwent the DNA extraction process in the immunochromatographic test and vice versa, of great value for the analysis of rare specimens, as is the case of Paleoparasitological ones.
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/6152
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