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Title: Caracterização molecular e determinação da carga viral do calicivírus felino em amostras de conjuntiva e de orofaringe de gatos domésticos no Rio de Janeiro
Authors: Pereira, Joylson de Jesus
metadata.dc.contributor.advisor: Castro, Tatiana Xavier de
metadata.dc.contributor.advisorco: Pinto, Ana Maria Viana
metadata.dc.contributor.members: Fumian, Túlio Machado
Varella, Rafael Brandão
Issue Date: 2017
Publisher: Universidade Federal Fluminense
Abstract: O Calicivírus felino (FCV) está associado à ulceração oral, a doenças respiratória e ocular e a quadros sistêmicos em felinos domésticos. O vírus apresenta uma grande variabilidade genética, o que resulta em falhas vacinais, ocorrência de animais portadores com infecção subclínica e a circulação de variantes virulentas com elevada taxa de mortalidade. Até o momento não foram descritas as variantes e genótipos que estão em circulação no estado do Rio de Janeiro ou se existe a associação entre carga viral do FCV e os sinais clínicos nos animais. O objetivo deste trabalho foi, portanto, realizar o isolamento, a caracterização molecular das variantes de FCV e a quantificação da carga viral em amostras de conjuntiva e orofaringe em gatos domésticos no estado do Rio de Janeiro. Para o isolamento viral e caracterização molecular, foram selecionadas 26 amostras de swabs conjuntivais coletados em 2013 e 2015. Para a determinação da carga viral foram utilizadas 76 amostras (38 de conjuntiva e 38 de orofaringe) coletadas em 2015. O isolamento viral foi realizado em células CRFK (Crandell-Reese Feline Kidney) seguido de extração do genoma e Reação de PCR precedida de transcrição reversa (RT-PCR) para as regiões conservadas A e B e variáveis C a E do capsídeo viral. Um total de 14 isolados apresentaram eletroferograma de qualidade para região conservada e oito para região variável do genoma. Para a região conservada, as amostras formaram dois grupos (I, II) e o grupo I foi subdividido em Ia e Ib com valor 1.00 de aLTR. A maioria dos isolados deste estudo agrupou no grupo Ia enquanto que a amostra RJ120/2015 agrupou no grupo II (valor de aLTR = 1) junto com a cepa vacinal F9 e outros dois protótipos. Na análise de região variável, as sequências também agruparam formando dois grupos (I e II) e o grupo II foi subdividido nos subgrupos IIa e IIb (valor de aLTR = 0,88). A maioria dos isolados deste estudo agrupou no grupo I onde a amostra RJ029/2013 agrupou num clado com o protótipo F9, dois isolados brasileiros e outros dois protótipos. As amostras RJ029/2013 e RJ120/2015 demonstraram uma relação muito próxima com F9 e foram consideradas variantes vacinais. Das duas, só a amostra RJ120/2015 foi oriunda de um gato vacinado. Em relação à qRT-PCR, seis (15,78%) swabs conjuntivais e 19 (50%) swabs de orofaringe foram considerados positivos. No momento da coleta, 22 animais apresentaram sintomatologia ocular e somente dois sintomatologia oral; 10 apresentavam sinais respiratórios, dos quais seis foram considerados positivos. Seis dos animais receberam, pelo menos, uma dose vacinal, dos quais dois foram considerados positivos. O número de animais positivos para FCV foi maior em amostras de orofaringe do que em conjuntiva. Cinco animais foram positivos tanto em swabs de conjuntiva quanto de orofaringe independente da presença de sintomatologia clínica. Quanto ao score ocular, não foi observado variação de carga viral em nenhum score. Sabe-se que FCV não é o principal agente causador de conjuntivite em gatos e a presença do vírus na conjuntiva poderia ser justificada pelo grooming realizado pelos gatos. No que diz respeito ao score oral, a carga viral de orofaringe foi maior nos únicos dois animais com score um. Seria necessário um estudo mais amplo com animais apresentando alterações em cavidade oral para confirmar este achado. Conclui-se, então, que para uma classificação filogenética do FCV é necessário o sequenciamento completo do genoma viral e é possível a detecção de variantes vacinais na população onde há gatos vacinados. O vírus não foi associado a quadros de conjuntivite ou sinais em cavidade oral, mas foi encontrado na conjuntiva e cavidade oral tanto de gatos sintomáticos quanto assintomáticos. Tal fato associado ao grooming em felinos explica a ampla disseminação do vírus na população.
metadata.dc.description.abstractother: Feline calicivirus (FCV) is associated with oral ulceration, as well as respiratory, ocular and systemic disease in cats. The virus has a great genetic variability, which results in vaccine failures, occurrence of subclinical and asymptomatic carriers and circulation of virulent variants with high mortality. So far, no variants and genotypes have been reported in the state of Rio de Janeiro or if there is an association between FCV viral load and the animals’ clinical signs. The objective of this work was to perform the molecular characterization of FCV variants and quantification of viral load in conjunctiva and oropharynx in cats from Rio de Janeiro. For viral isolation and molecular characterization, 26 samples of conjunctival swabs collected in 2013 and 2015 were selected. For the determination of viral load, 76 samples (38 from conjunctiva and 38 from oropharynx) were collected in 2015. Virus isolation was performed in CRFK cells (Crandell-Reese Feline Kidney) followed by genome extraction and RT-PCR reaction for the conserved A and B regions and for the variable C-E regions of the viral capsid. A total of 14 consensus sequences were of sufficient quality for conserved region and eight for variable region of the genome. For phylogenetic analysis, a 0.80 approximate Likelihood Ratio Test (aLTR) was considered significant. For the conserved region, samples and prototypes formed two groups (I, II) and group I was subdivided into Ia and Ib with a 1.00 value of aLTR. Most of the isolates from this study grouped in group Ia while the sample RJ120/2015 grouped in group II (aLTR value = 1) together with the vaccine strain F9 and other two prototypes. In the variable region analysis, the sequences also grouped into two groups (I and II) and group II was subdivided into subgroups IIa and IIb (aLTR value = 0.88). Most of the isolates from this study grouped in group I where the sample RJ029/2013 grouped in a clade with the F9 prototype, two Brazilian isolates and two other prototypes. Samples RJ029/2013 and RJ120/2015 demonstrated a very close relationship with F9 and were considered vaccine variants. However, only sample RJ120/2015 came from a vaccinated cat. Regarding qRT-PCR, six (15.78%) conjunctival swabs and 19 (50%) oropharynx swabs were considered positive. At the time of collection, 22 animals presented ocular symptomatology and only two oral symptomatology; 10 presented respiratory signs, of which six were considered positive. Six of the animals received at least one vaccine dose, of which two were considered positive. The number of animals positive for FCV was greater in oropharynx than in conjunctiva. Five animals were positive in both conjunctival and oropharynx swabs regardless of the presence of clinical symptomatology. As for the ocular score, no variation of viral load was observed at any score. FCV is not the main causative agent of conjunctivitis in cats and the presence of the virus in the conjunctiva could be justified by the grooming performed by the cats. Regarding the oral score, the oropharyngeal viral load was higher for the only two animals with score one. A larger study with animals presenting oral cavity alterations would be necessary to confirm this finding. It is concluded that for a phylogenetic classification of FCV, a complete sequencing of the viral genome is necessary and it is possible to detect vaccine variants in the population where there are vaccinated cats. Virus was not associated with conjunctivitis or oral signs, but it was found in the conjunctiva and oral cavity of both symptomatic and asymptomatic cats. This fact associated with grooming explains the wide spread of the virus in the population.
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/6153
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