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Title: Diagnóstico molecular de Herpesvirus felino -1, Calicivirus felino, Mycoplasma felis e Chlamydophila felis associado à conjutivite felina
Authors: Baumworcel, Natasha
metadata.dc.contributor.advisor: Castro, Tatiana xavier de
metadata.dc.contributor.advisorco: Soares, Ana Maria Barros
metadata.dc.contributor.members: Santos, Gina Peres Lima dos
Pereira, João Telhado
Neves, Felipe Piedade Gonçalves
Issue Date: 2014
Publisher: Universidade Federal Fuminense
Abstract: A conjuntivite felina é uma enfermidade frequente em animais domiciliados, de abrigos e de vida livre. Os microorganismos associados com maior frequência a conjuntivite são: herpesvirus felino tipo-1 (FHV-1), calicivirus felino (FCV), Mycoplasma felis (M. felis) e Chlamydophila felis (C. felis). Estes agentes vêm sendo identificados sozinhos ou em infecções polimicrobianas, mas não existem até o momento, dados disponíveis que associem a gravidade dos sinais clínicos oftalmológicos com esses patógenos, bem como quais as variantes destes agentes em circulação na região metropolitana do Rio de Janeiro. O objetivo geral deste trabalho foi realizar o diagnóstico molecular dos principais agentes microbiológicos associados à conjuntivite felina e realizar a caracterização molecular de FHV-1 e FCV encontrados nas cidades do Rio de Janeiro e Niterói. Foram realizados 108 coletas por meio de citobrush de conjuntiva de gatos assintomáticos (G1, n=40) e com sinais de conjuntivite (G2, n=68). A idade dos animais variou de 2 meses a 1 ano. Os sinais oftalmológicos de conjuntivite foram categorizados conforme a gravidade em um escore de 1 a 4. O genoma (DNA e RNA) foi extraído, o cDNA sintetizado imediatamente após o término da extração. A reação em cadeia pela polimerase (PCR) e Nested-PCR para detecção de agentes virais foram realizadas utilizando pares de iniciadores que amplificam: um fragmento de 287 pb do gene que codifica para a enzima timidina quinase (TK) dos FHV-1 e um fragmento de 467 pb do gene que codifica para RNA polimerase RNA dependente (RpRd) dos FCV. A PCR foi realizada para os agentes bacterianos utilizando pares de iniciadores que amplificam um fragmento de 187 pb do gene que codifica para o 16S/23S rRNA intergênico de M. felis e um fragmento de 1094 pb do gene que codifica para a região do 16S de C. felis. Foi realizado o sequenciamento e análise filogenética das amostras positivas para FHV-1, FCV e dos controles positivos de M. felis e C. felis. O genoma do FHV-1 foi detectado em 62/108 amostras, do FCV em 40/108, M. felis em 11/108 e C.felis em 26/108. Infecções polimicrobianas foram detectadas em 39/108 amostras. Foi realizado sequenciamento e análise filogenética do gene que codifica para TK de 23 amostras positivas para FHV-1. Esta região apresentou pouca variabilidade genética e não foi possível estabelecer uma associação entre as características genéticas da amostra com o local de coleta ou sinais clínicos dos animais. Oito amostras de FCV foram sequenciadas e a análise do fragmento de RdRp evidenciou a formação de dois clusters distintos, um deles constituído somente por amostras deste estudo e outro por amostras deste estudo e protótipos disponíveis no Genbank, sugerindo a circulação de duas variantes distintas de FCV. Em G1 (40 olhos), 70,0% das amostras foram positivas para um ou mais agentes pesquisados. Em G2, 85,3% das amostras foram positivas para um ou mais agentes pesquisados, sendo que 17,2% para FHV-1,3,4% para FCV, 1,7% para M.felis e 1,7% para C. felis. As coinfecções representaram 51,5% das amostras. Estes dados reforçam a importância do diagnóstico molecular possibilitando ao clinico o direcionamento de uma terapêutica adequada, permitindo adoção de técnicas de manejo eficientes no controle destes agentes. O FHV-1 foi o patógeno mais frequente em G1. Concluiu-se que escores mais altos estão relacionados aos casos de co-infecções. E, por último, M. felis e C.felis são patógenos oportunistas nos casos de conjuntivite.
metadata.dc.description.abstractother: Feline conjunctivitis is a common disease in animal shelters and in feral cats. The most frequently microorganisms associated with conjunctivitis are: feline herpesvirus type 1 (FHV-1), feline calicivirus (FCV), Mycoplasma felis (M. felis) and Chlamydophila felis (C. felis). These pathogens have been identified alone or in multiple microorganisms infections in several countries but there are no data available associating clinical signs with these microorganisms. There is no data also about variants that are circulating in Rio de Janeiro. The aim of this study was to perform molecular diagnosis of microbiological agents. and to do molecular characterization of FHV-1 and FCV circulating in Rio de Janeiro and Niteroi cities. A total of 108 conjunctival citobrush samples were collected of either asymptomatic (G1, n=40) and symptomatic (G2, n=68) kittens. Conjunctivitis signals were classified according to the severity based on scores from 1 to 4. The genome (DNA and RNA) was extracted, cDNA was prepared immediately after the extraction and Nested-PCR and PCR carried out using primer pairs which amplify respectively a 287 bp fragment of the gene coding for the enzyme thimidina kinase (TK) of the FHV-1 and a fragment of 467 bp of the RNAdependent RNA polymerase (RdRp) of FCV. For bacterial microorganisms a fragment of 187 bp of the gene encoding the rRNA 16S/23S intergenic M. felis and a fragment of 1094 bp of the gene encoding the region 16S C. felis were used. Sequencing and phylogenetic analysis of samples positive for FCV and FHV-1 were performed as for positive controls of M. felis and C.felis. The genome of FHV-1 was detected in 62/108 of the samples tested, FCV in 40/108; M. felis in 11/108 and C.felis in 26/108. Multi microorganisms infections were detected in 39/108 samples. Twentythree positive samples for FHV-1 were sequenced for the gene that encodes for TK and there was no variability among them. An association between the genetic characteristics of the study with the local sample collection or clinical signs region could not be established. Eight samples of FCV were sequenced and the analysis of the fragment revealed the formation of two phylogenetically distinct clusters, one with only samples of this study, and the other one with samples from this study and prototipes available at GenBank, suggesting that there are two variants of FCV circulating. G1 (40 eyes), 70.0% of samples were positive for one or more microorganisms. On G2 (68 eyes), 85.3% were positive for one or more agents. Out of the positive samples 17.2% were for FHV-1, 3.4% for FCV, and 1.7% for M.felis and C. felis each. The co-infections accounted for 51.5%. Data shown in this study reinforce the idea that molecular diagnosis helps the cinician make better decisions on therapeutic approach.It was concluded that FHV-1 was the most frequent microorganism detected in G1. M. felis and C. felis are opportunistic pathogens of conjunctivitis, and higher clinical scores were related to co-infections.
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/6255
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