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Title: Desenvolvimento de metodologia analítica para determinação de anfetamina, metanfetamina e famprofasona em sangue e fígado após administração controlada de famprofasona em suínos
Authors: Silva, Cassia Maria Lins da
metadata.dc.contributor.advisor: Rodrigues, Silvana Vianna
metadata.dc.contributor.advisorco: Spinelli, Eliani
metadata.dc.contributor.members: Peluso, Yara
Moreira, Josino Costa
Pereira, Henrique Marcelo Gualberto
Pacheco, Wagner Felippe
Semaan, Felipe Silva
Issue Date: 2018
Publisher: Universidade Federal Fluminense
Abstract: Na pesquisa toxicológica forense as matrizes biológicas usadas, tanto podem ser coletadas de indivíduos vivos quanto após a morte, e a preparação da amostra biológica é um fator crítico do processo analítico. Os procedimentos são específicos tanto para o agente pesquisado como para a matriz utilizada. Outra questão é a interpretação dos resultados, além dos fenômenos post-mortem, envolvidos na literatura, há poucos estudos de correlação entre os valores sanguíneos e demais tecidos. Esse estudo propôs desenvolver um método de preparo de amostras para posterior doseamento de anfetamina, metanfetamina e famprofasona em amostras de fígado e sangue, e aplica-lo em amostras autênticas coletadas de suínos após administração controlada de famprofasona. Neste estudo foram avaliadas as seguintes etapas: (1) dispersão celular, através do uso de colagenase, de modo a aumentar a superfície de contato na etapa de extração; (2) procedimento de remoção de proteínas das amostras; (3) extração/clean-up dos analitos; (4) desenvolvimento e validação de método cromatográfico e (5) experimentos in vivo e análise de amostras reais. A dispersão celular foi de 92,8±0,9 % da massa com 91,0±1,2 % do colágeno hidrolisado nas condições propostas. Na otimização do procedimento enzimático, foi necessário desenvolver um procedimento rápido, simples, e adequado de modo a avaliar-se a eficiência do processo de dispersão. Com a desproteinização das amostras, em estudo, foram obtidos aproximadamente 91 % de remoção proteica, com ZnSO4 (6% m/v), e 95 % para a mistura equimolar de Na3Cit/AlCl3 (0,7 mol L-1). Para a LC-MS ficou definido como solução A, uma solução de ácido fórmico a 0,015 %, e acetonitrila com 0,015 % de ácido fórmico como solução B, com eluição no modo de gradiente com um tempo total de 12 min. Após a otimização do procedimento de extração por SPE, o desproteinizante Na3Cit/AlCl3 foi selecionado por apresentar maior recuperação para todos os analitos em ambas matrizes, principalmente para a famprofasona com uma diferença entre os valores percentuais de recuperação de aproximadamente 21 e 27 %, para o sangue e fígado, respectivamente. O método foi validado, e apresentou limite detecção igual a 5 ng g-1 para os três analitos no fígado. Enquanto que para o sangue, obteve-se 0,6 ng mL-1 para a anfetamina e 1,0 ng mL-1 para a metanfetamina e famprofasona. Os limites de quantificação dos três analitos ficaram em 5 ng g-1 para o fígado e 1,0 ng mL-1 para o sangue. Os dados das curvas analíticas da metanfetamina em fígado foram os únicos a apresentar homocedasticidade, e a faixa de trabalho selecionada foi de 5 a 150 ng g-1. Para as curvas analíticas de anfetamina e famprofasona em fígado e, de anfetamina, famprofasona e metanfetamina em sangue que apresentaram comportamento heterocedástico, procedeu-se com a transformação dos dados para o formato de logX e logY. No fígado, a faixa de concentração de trabalho, para a anfetamina ficou entre 5 e 200 ng g-1, e para a famprofasona entre 5 e 150 ng g-1. Para o sangue, o intervalo de concentração ficou entre 1 e 40 ng mL-1 para a anfetamina e metanfetamina, e de 1 a 50 ng mL-1 para a famprofasona. A avaliação da precisão nos três níveis de concentração, através da repetibilidade e precisão intermediária, apresentou resultados de coeficientes de variação menores que 6 % e valores de erro relativo menores que 8 % no fígado para os três analitos. No sangue os valores foram abaixo de 11 % para o coeficiente de variação e menores que 7 % para o erro relativo para os três analitos. Em relação a exatidão nos três níveis de concentração no fígado, os valores ficaram abaixo de 14 % para os três analitos. No sangue, os valores foram inferiores a 10 % para os três analitos. O método foi aplicado a amostras reais, obtidas de um único indivíduo, que recebeu 200 mg de famprofasona por dia, por um período de cinco dias, e duas horas antes do abate.
metadata.dc.description.abstractother: In forensic toxicology research the biological matrices used can be collected from both living and dead individuals, and the preparation of the biological sample is a critical factor of the analytical process. The procedures are specific for both the investigated agent and the matrix used. Another issue is the interpretation of results, in addition to the postmortem phenomena involved in the literature, there are few studies of correlation between blood values and other tissues. This study proposed to develop a method of preparing and assaying amphetamine, methamphetamine and famprofazone in liver and blood samples and applying it to real samples collected from pigs after controlled administration of famprofazone. In this study, the following steps were evaluated: (1) cell dispersion, with collagenase, in order to increase the contact surface in the extraction stage; (2) protein removal procedure from samples; (3) extraction / clean up of analytes; (4) development and validation of chromatographic method and (5) in vivo experiments and analysis of real samples. The cell dispersion was 92.8 ±0.9% of the mass with 91.0±1.2% of the collagen hydrolyzed under the proposed conditions. In the optimization of the enzymatic procedure, it was necessary to develop a fast, simple, and adequate procedure in order to evaluate the efficiency of the dispersion process. With the deproteinization of the samples under study, approximately 91 % protein removal were obtained, with ZnSO4 (6% m / v), and 95% for the equimolar mixture of Na3Cit/AlCl3 (0.7 mol L-1). For the LC-MS, a solution of 0.015% formic acid was defined as solution A, and acetonitrile with 0.015% formic acid as solution B. The elution was in the gradient mode with a total time of 12 min. After the optimization of the SPE extraction procedure, the deproteinizing agent Na3Cit/AlCl3 was selected because it presented a higher recovery for all the analytes in both matrices, mainly for famprofazone with a difference between the recovery values of approximately 21% for blood and 27% for liver. The method was validated, and the detection limit was 5 ng g-1 for the three analytes in the liver. While for blood, values of 0.6 ng mL-1 for amphetamine and 1.0 ng mL-1 for methamphetamine and famprofazone were obtained. The quantification limits for the three analytes were 5 ng g-1 for the liver and 1.0 ng mL-1 for the blood. The data from the methamphetamine liver curves were the only ones to present homoscedasticity, and the selected work range was between 5 and 150 ng g-1. For the analytical curves of amphetamine and famprofazone in liver and of amphetamine, famprofazone and methamphetamine in blood, the data were adjusted to the logX and logY format. In the liver, the working concentration range for amphetamine was between 5 and 200 ng g-1, and for famprofazone between 5 and 150 ng g-1. For blood, the concentration range was between 1 and 40 ng mL-1 for both amphetamine and methamphetamine, and 1 to 50 ng mL-1 for famprofazone. The accuracy of the three levels of concentration, through repeatability and intermediate precision, showed results of coefficients of variation lower than 6% and relative error values lower than 8% in the liver for the three analytes. In blood, the values were below 11% for the coefficient of variation and less than 7% for the relative error for the three analytes. Regarding the accuracy in the three liver concentration levels, the values were below 14% for the three analytes. In blood, the values were less than 10% for the three analytes. The method was applied to real samples, obtained from a single subject, who received 200 mg of famprofazone per day for a period of five days and two hours prior to slaughter.
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/7835
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