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Title: Plasticidade epitelial em células de câncer de próstata (PC3) tratadas com TGF-β: relação com a expressão de isoformas da osteopontina (OPN) e reguladores do splicing
Authors: Marques, Durval Santos
metadata.dc.contributor.advisor: Gimba, Etel Rodrigues Pereira
metadata.dc.contributor.members: Kubrusly, Regina Célia Cussa
Alves, Leandro Miranda
Souza, Pedro Barcellos de
Marostica, Elisabeth
Issue Date: 2018
Citation: Marques, Durval Santos. Plasticidade epitelial em células de câncer de próstata PC3 tratadas com TGF-β: relação com a expressão de isoformas da osteopontina (OPN) e reguladores do splicing. 2018.104f. Tese (Doutorado em Ciências Biomédicas - Fisiologia) – Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2018.
Abstract: A plasticidade celular mediada pelos processos de transição epitélio mesenquimal (EMT) e transição mesenquimal epitelial (MET) é um indispensável recurso para diversos processos fisiológicos e patológicos, incluindo o câncer de próstata (CaP). O aumento na expressão e ativação de TGF-β promove uma resposta na plasticidade epitelial que pode seguir tanto a transição EMT quanto a MET. Alguns modelos tumorais demonstraram que a osteopontina (OPN) pode induzir alterações moleculares no programa de EMT. A diversidade funcional da OPN tem sido associada com diversas alterações pós-transcricionais, incluindo a existência de isoformas variantes de splicing (OPNa, OPNb e OPNc). No entanto, o papel da OPN e de suas variantes de splicing, em associação com o TGF-β, na plasticidade tecidual relacionada à progressão do CaP, ainda não foram investigados. Este trabalho objetivou avaliar o perfil de expressão das isoformas de splicing da OPN e o fenótipo celular gerado em resposta ao tratamento de células PC-3 com TGF-β. Além disto, avaliar possíveis associações destes perfis com a expressão de co-reguladores do splicing. Para alcançar nossos objetivos, a linhagem celular metastática de câncer de próstata PC-3, foi cultivada em condições ideais e as células foram estimuladas com TGF-β. As técnicas de qRT-PCR em tempo real, imunofluorescência, migração e viabilidade celular foram utilizadas. Observamos em nossos resultados que as células PC-3 tratadas com TGF-β apresentaram diminuição no nível de expressão de transcritos codificadores dos marcadores epiteliais (E-CADERINA, CLAUDINA-3 E CITOQUERATINA-18) e mesenquimais (N-CADERINA, VIMENTINA, SLUG, SNAIL) testados, sendo que dentre os marcadores epiteliais, somente a E-CADERINA diminui significativamente. Já no ensaio de imunofluorescência, observamos aumento na intensidade de marcação citoplasmática da CLAUDINA-3 e E-CADERINA por outro lado, houve diminuição na expressão da intensidade de marcação de VIMENTINA, além de mudança no padrão de distribuição espacial das fibras de ACTINA. As Células tratadas também apresentaram um menor potencial migratório, quando comparadas ao controle, além de aumento na sensibilidade ao fármaco citotóxico β-lapachona. Em resposta ao tratamento com TGF-β, houve diminuição significativa na expressão dos transcritos codificadores das isoformas OPNa, OPNb e OPNc, associado à diminuição na expressão na maioria dos fatores reguladores do splicing testados. Concluímos que o tratamento com TGF-β foi capaz de modular nas células PC-3 uma resposta à expressão gênica, proteica e fenotípica, fazendo com que estas células apresentem características similares ao fenótipo de EMT intermediário, predominantemente epitelial, o qual pode estar associado à aquisição de características epiteliais por células metastáticas que precisam se aderir para promover implementação em sítio tumoral secundário. Este trabalho abre perspectivas do envolvimento do papel das isoformas da OPN na plasticidade epitelial-mesenquimal em resposta ao TGF-β e na biologia tumoral do CaP.
metadata.dc.description.abstractother: Cellular plasticity mediated by epithelial-mesenchymal transition (EMT) and MET (mesenchymal-epithelial transition) processes is an indispensable resource for several physiological and pathological processes, including prostate cancer (PCa). The increased expression and activation by TGF-β promotes a response in epithelial plasticity that may induce as well MET transition. Some tumor models have demonstrated that osteopontin (OPN) may induce molecular changes in the EMT program. The functional diversity of OPN has been associated with several post-transcriptional modifications, including the existence of variant splicing isoforms (OPNa, OPNb and OPNc). However, the role of OPN and its splicing variants, in association with TGF-β, in tissue plasticity related to PCa progression of has not been adressed. This work aimed to evaluate the expression profile of OPN splicing isoforms and the cell phenotype generated in response to PC-3 PCa metastatic cell line treated with TGF-β, in order to evaluate putative associations of these expression patterns profiles with the expression of splicing regulators. To achieve our aims, PC-3 cells were cultured under ideal conditions and were stimulated with TGF-β. Real-time q-PCR, immunofluorescence, migration and cell viability techniques were used. We observed in our data PC-3 cells treated with TGF-β showed a decreased expression level of of transcripts encoding the epithelial (E-CADHERIN, CLAUDIN-3 AND CITOQUERATIN-18) and mesenchymal (N-CADERIN, VIMENTIN, SLUG, SNAIL) tested markers, while among the epithelial markers, E-CADERIN was the only transcript whose expression levels significantly decreased. Using mmunofluorescence assays, we found an increased cytoplasmic staining intensity for CLAUDIN-3 and E-CADHERIN. On the other hand, there was a decreased VIMENTIN staining intensity, in addition to a change in the spatial distribution pattern of ACTIN fibers. The TGF-β-treated cells also had a lower migratory potential when compared to control cells, in addition to an increased in sensitivity to cytotoxic β-lapachone drug. In response to TGF-β treatment, there was a significant decrease in transcript expression levels of OPNa, OPNb and OPNc isoforms, associated with a decreased expression of most tested splicing regulators. We concluded that TGF-β treatment was able to modulate in PC-3 cells a response in gene expression, protein and phenotypic, making these cells acquiring features similar to the intermediate EMT, predominantly epithelial, which may be associated to acquisition of epithelial features by metastatic cells that need to adhere in order to promote implementation at a tumor secondary site. This work open new avenues to a better understanding regarding the involvement of OPN isoforms in EMT plasticity in response to TGF-β and PCa biology.
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/8455
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