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Title: Entendendo os mecanismos moleculares envolvidos com a adesão do osteoblastos: possível envolvimento da proteína tirosina fosfotase de baixa massa
Authors: Fernandes, Gustavo Vicentis de Oliveira
metadata.dc.contributor.advisor: Zambuzzi, Willian Fernando
metadata.dc.contributor.advisorco: Olej, Beni
metadata.dc.contributor.members: Fonseca, Clóvis Orlando Pereira da
Alves, Gutemberg Gomes
Lima, Ingrid Russoni de
Issue Date: 2011
Citation: FERNANDES, Gustavo Vicentis de Oliveira. Entendendo os mecanismos moleculares envolvidos com a adesão do osteoblastos: possível envolvimento da proteína tirosina fosfotase de baixa massa. 2011. 55 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2011.
Abstract: A interação das células com seu ambiente externo provoca modulação de diferentes vias de sinalização em cascata, que culmina em uma resposta específica. Este mecanismo de transdução de sinal é regido predominantemente por mecanismos transientes de fosforilação e desfosforilação em resíduos de tirosina (Y), executados por quinases (PTK) e fosfatases (PTP), respectivamente. Com a finalidade de conhecer os mecanismos de transdução de sinais envolvidos com a adesão de osteoblastos, nosso grupo de pesquisa tem estudado o envolvimento de diferentes proteínas e proposto um mecanismo global deste evento biológico. A despeito dos últimos artigos documentando a adesão de osteoblastos, pouco se sabe sobre o envolvimento de Espécies Reativas de Oxigênio (Reactive Oxygen Species - ROS) e Proteína Tirosina Fosfatase de Baixo Peso Molecular (Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase - LMWPTP) nestes eventos. Assim, este trabalho preocupou-se em estudar o envolvimento de ROS e LMWPTP durante adesão de osteoblastos, aventando a possibilidade de ROS modular a atividade de LMWPTP. Assim, células MC3T3-E1 (pré-osteoblastos) foram plaqueadas e amostras biológicas coletadas após 30 minutos e 2 horas. Inicialmente foi feito uma análise das modificações morfológicas destas células através de microscopia de confocal. Nossos dados confirmaram dados previamente publicados de que, durante estes eventos iniciais de adesão de osteoblastos, há modificações morfológicas significantes, despertando o interesse de conhecer os mecanismos de transdução de sinais responsáveis por estas modificações. Para avaliar a quantidade de peróxido de hidrogênio (H2O2) utilizamos citometria de fluxo, através do método de DHR 123. Qualitativamente, nossos resultados mostraram que aos 30 minutos a quantidade de H2O2 era maior do que àquela encontrada no período de 2 horas. Avaliando posteriormente a fosforilação de FAK no resíduo Y397 e de Src no resíduo Y416, mostramos que ambos eram maior no período de 30 minutos, sugerindo a atividade de uma PTP específica, que talvez fosse modulada pela sinalização de ROS. A despeito de sua expressão permanecer inalterada nos 2 períodos de análise, sugerimos em testes funcionais que LMWPTP era capaz de controlar ambas fosforilações em Y (416 e 397). Estes testes se basearam nas abordagens de silenciamento e super-expressão de LMWPTP, com posterior análise dos níveis de fosforilações por immunoblotting. Além disso, avaliamos a atividade de catalase e superóxido dismutase nestes períodos e verificamos que ambas estavam com atividade aumentada no período de 2 horas, sugerindo controle da quantidade de ROS. Juntos, esses dados sugerem que ROS é capaz de modular a fosforilação de FAK e Src através do controle direto da atividade de LMWPTP. Além disso, sugerimos que durante a adesão de osteoblastos há uma interação supra-molecular de FAK/Src/LMWPTP, formando um complexo capaz de controlar respostas transientes e imediatas via ativação de integrinas durante estes eventos
metadata.dc.description.abstractother: It is very known that eukaryotic cells interactions with their external environment provoke a modulation of different signaling pathways triggered in cascade form, culminating on specific responses. In general, it is governed by transient phosphorylation and dephosphorylation on tyrosine residues (Y), executed by kinases (called PTK) and phosphatases (called PTP), respectively. In order to understand the mechanisms of signal transduction involved on osteoblast adhesion, our research group has studied the involvement of different signaling proteins and proposed a global mechanism of this biological event. Despite recent articles reporting osteoblast adhesion, the involvement of Reactive Oxygen Species (ROS) and Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase (LMWPTP) remains unclear. In this way, our main goal was to evaluate the involvement of ROS and LMWPTP during osteoblast adhesion, verifying the possibility of ROS to modulate the LMWPTP activity. Thus, MC3T3-E1 cells (pre-osteoblasts lineage) were plated and biological samples collected after 30 minutes and 2 hours. Firstly, we decided to investigate the morphological changes required during osteobalst adhesion by using confocal microscopy approach. Our data showed that there were significant morphological changes, ranging from round to spread cells. Secondly, to assess the amount of hydrogen peroxide (H2O2) was used flow cytometry, through the method of DHR 123. These data showed that the amount of H2O2 was greater at 30 minutes than that found up to 2 hours of seeding. At the same periods, we also assessed the phosphorylation level of FAK at residue Y397 (autophosphorylation) and Src at Y416 (autophosphorylation) and we showed that both were higher at first 30 minutes than 2 hours. After, we decided to evaluate LMWPTP in this context. Despite its expression remained unchanged, we suggested that LMWPTP activity was modulated by ROS content fluctuation up to 2 hours. Thereafter, functional assays (by silencing or over-expressing LMWPTP) in fact showed that LMWPTP was able to control both Y-phosphorylations (416 and 397). In addition, we evaluated the activity of catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) in these periods and found that both were up-regulated at 2 hours, suggesting control of the amount of ROS at this time. Altogether, these data suggest that ROS can modulate the phosphorylation of FAK and Src through direct control of the LMWPTP activity. In addition, we suggest that osteoblasts adhesion promotes a supra-molecular interaction of FAK / Src / LMWPTP, assembling a complex able to respond transiently upon integrin activation
URI: https://app.uff.br/riuff/handle/1/9740
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