Caracterização dos mecanismos de interação do hospedeiro ambiental Acanthamoeba castellanii com fungos patogênicos e seu impacto na virulência fungica

Abstract

Amebas de vida livre (AVLs) são organismos ubíquos, distribuindo-se desde solos a áreas alagadas. Entretanto, inúmeras espécies de AVLs tem sidos descritas como contaminante de águas de uso humano. AVLs vem sendo relatado como veículos de outros microrganismos, no seu interior, facilitando a outros patógenos acesso a diferentes áreas ou até mesmo a vertebrados superiores. Assim como as AVLs, os fungos são por natureza ubíquotos e por fim acabam coexistindo. Dentre as espécies de AVLs, a Acanthamoeba castellanii (Ac) é a mais caracterizada com relação à sua atividade micofágica. Entretanto, muitas espécies fungicas são capazes de resistir a atividade fagocítica de Ac, permanecendo viáveis em seu interior. A partir desta observação, diversos autores vêm estudando a interação entre esses microrganismos, uma vez que ambos são patógenos em potencial com larga distribuição ecológica. No presente trabalho avaliamos as interações de Ac com fungos, o que pode resultar diretamente na modificação da virulência de espécies fúngicas. Caracterizamos a cinética de interação entre Ac-fungos e sua dependência relacionada a parâmetros, como tempo e multiplicidade de infecção. Investigamos a participação de receptores de superfície, capazes de reconhecer moléculas presentes nas superfícies da parede celular fúngica e facilitar a adesão/entrada destas leveduras aos trofozoítos. Utilizando extratos protéicos biotinilados da membrana de Ac, foram usados relacionados à ligação manose purificada ou presente na superfície fúngica. Como principal ineditismo deste trabalho, identificamos através de espectrometria de massas, duas proteínas de Ac capazes de reconhecer resíduos de manose (MBP, L8WXW7 e MBP1, Q6J288), participando como receptores fúngicos. A partir dos dados obtidos da espectrometria de massas, obtivemos a estrutura molecular tridimensional, tal como o esclarecimento da importância dessa proteína no processo da interação. Como a interação não pode ser inibida completamente, quando inibido os receptores MBP, levantou a hipótese de outros receptores envolvidos no processo de interação Ac-fungos. O reconhecimento do polissacarídeo majoritário na superfície fúngica, β-1,3-glucana, foi uma das evidências encontradas após diferentes análises. O uso da proteína-de-fusão dectina-1-Fc (IgG2b), em conjunto com extratos biotinilados de Ac demonstrou co-localização à paredes celular fúngica, indicando o reconhecimento de β-1,3-glucana por Ac. Foi descrito pela primeira vez, a secreção de vesículas extracelulares por Ac. Caracterizamos a morfologia, composição lipídica e proteica desses vesículas extracelulares (EVs) e a determinação de componentes protéicos na fração não particulada (sobrenadante livre de vesículas) secretadas por Ac. Foi descrito a participação, tanto das EVs como da fração não-particulada, no processo de dano celular causado por Ac. Ensaios de citotoxicidade com linhagens de células animais demonstrou efeito citotóxico do secretoma, capaz de induzir necrose ou apoptose nestas linhagens celulares, respectivamente, deixando clara a importância deste secretoma na patogênese de A.castellanii. Adicionalmente, demonstramos o efeito do secretoma de Ac sobre a virulência das leveduras. O tratamento destes fungos com EVs ou fração particulada do secretoma de Ac, provocou diferentes efeitos sobre a biologia destes fungos como: aumento na taxa de crescimento das leveduras, efeito sobre a transição morfológica (levedura-filamento), aumento na fagocitose pela própria Ac e aumento da virulência quando utilizado as células tratadas com as diferentes frações do secretoma em modelos de infecção fúngica utilizando larvas de Galleria mellonella. Todos os dados obtidos ao longo desta tese demonstram a grande importância da interação ecológica entre Ac e fungos, contribuindo com evidencias de como esta AVL pode exercer a pressão seletiva, aumentando a virulência fúngica a hospedeiros vertebrados superiores.