CRISPR em enterococos: distribuição, correlação com virulência, resistência a antimicrobianos e edição gênica

Abstract

As infecções enterocócicas são consideradas graves ameaças à saúde pública, sobretudo diante de seu potencial oportunista e de sua característica de multirresistência, notadamente das cepas de enterococos resistentes à vancomicina (VRE). Dez genótipos de resistência foram descritos para vancomicina, uma das drogas de última linha para o tratamento de infecções enterocócicas graves. Entre estes, destacam-se vanA e vanB como os mais clinicamente relevantes. Alguns estudos associam à perda ou ausência de sistemas CRISPR-Cas (clustered, regularly interspaced short palindromic repeats – CRISPR associated) – um mecanismo de defesa contra a entrada de DNA exógeno – a um maior potencial de resistência e virulência entre os enterococos. Além disso, sistemas CRISPR-Cas têm sido usados como ferramenta de edição gênica com potencial para tratamento de doenças genéticas e infecciosas. O objetivo deste estudo foi avaliar a associação dos elementos CRISPR com o potencial de virulência e a resistência a antimicrobianos, além de desenhar uma ferramenta baseada no sistema CRISPR-Cas9 com o intuito reverter a resistência à vancomicina mediada pelos operons vanA e vanB. Foram analisadas 299 amostras de origem clínica obtidas entre agosto de 2012 e 2019 pertencentes à coleção de culturas do Laboratório de Cocos Gram Positivos (MIP/CMB/UFF). Todas as amostras foram identificadas por MALDI-TOF e os perfis de susceptibilidade aos antimicrobianos foram determinados por testes de disco-difusão. A investigação da presença de cinco genes de virulência, resistência a antimicrobianos e de três regiões CRISPR foi realizada por PCR. O desenho de gRNA para inativação dos operons vanA e vanB foi feito com auxílio do software da IDT. Do total, 146 (48,8%) amostras eram VRE (79 E. faecalis; 62 E. faecium; 3 E. gallinarum e 2 E. avium) e 153 (51,2%) eram enterococos sensíveis à vancomicina (VSE; 130 E. faecalis; 19 E. faecium; 2 E. gallinarum, 1 E. casseliflavus e 1 E. durans). Ao todo, 217 (72,6%) amostras eram multirresistentes (MDR). A não-susceptibilidade à eritromicina, fluoroquinolonas e penicilina foi identificada em 111 (37,1%) amostras, entre as quais 56 (50%) eram VRE da espécie E. faecium (VREfm) e 51 (46%) VRE da espécie E. faecalis (VREfs). Entre os genótipos de resistência, os mais frequentes foram erm(B) (n=108; 36,1%) para os macrolídeos, tet(M) (n=93; 31,1%) para tetraciclina, vanA (n=133; 44,5%) para os glicopeptídeos e aac(6’)-Ie+aph(2”)-Ia (n=62; 20.7%) para os aminoglicosídeos. Os genes de virulência gelE (n=149; 67,7%), asa1 (n=117; 53,2%) e esp (n=112; 50,9%) foram os mais comuns. Das 299 amostras, 168 (56,2%) apresentaram pelo menos uma região CRISPR investigada. CRISPR1-cas foi verificado em 75 (44,6%) amostras, CRISPR2 em 66 (39,3%) e CRISPR3-cas em 113 (67,3%). Elementos CRISPR foram mais comuns em E. faecalis do que em E. faecium (p<0.05). Associações significativas (p<0,05) com a ausência de elementos CRISPR foram observadas em amostras com fenótipo MDR e com a presença de genes de resistência [ant(6)-Ia, aph(3)-IIIa, erm(B) e vanA] e virulência (hyl e esp), porém associações positivas também foram verificadas entre a presença de elementos CRISPR com o fenótipo (tetraciclina) e genótipo de resistência tet(M) e virulência (gelE e asa1). Foram desenhados quatro diferentes gRNA com potencial para inativar o operon vanA e três gRNA para vanB. A eficiência dessa ferramenta em reverter a resistência à vancomicina constitui etapa futura. Nossos dados indicam maior presença de certos genes de resistência e virulência em amostras sem elementos CRISPR. Por outro lado, associações positivas com outros genes de resistência e virulência sugerem que a presença desses genes pode conferir uma vantagem adaptativa às cepas que os carreiam